《Pharmaceutics》：L19-Conjugated Gold Nanoparticles for the Specific Targeting of EDB-Containing Fibronectin in Neuroblastoma
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本文首次证实了纤维连接蛋白B结构域（FN-EDB）在神经母细胞瘤（NB）肿瘤微环境中的表达，并成功开发了L19抗体偶联金纳米颗粒（L19-AuNP）。该纳米探针在体外和体内（PDX模型）均表现出对FN-EDB的高特异性结合能力，并通过光声成像（PA）实现了对肿瘤的精准靶向与富集，为神经母细胞瘤的精准诊断与靶向治疗提供了新的诊疗一体化（Theranostic）平台。
引言：神经母细胞瘤的诊疗困境与FN-EDB靶点
神经母细胞瘤（Neuroblastoma, NB）是儿童最常见的颅外实体肿瘤，占儿童癌症相关死亡的12-15%。尽管近年来治疗手段有所进步，但当前的多模式疗法仍缺乏细胞特异性靶点，导致全身毒性和耐药性。因此，开发创新的肿瘤靶向纳米制剂，对于提高神经母细胞瘤的诊断和抗肿瘤疗效、同时减少脱靶副作用至关重要。
纤维连接蛋白B结构域（Fibronectin extra-domain B, FN-EDB）是纤维连接蛋白的一种癌胚亚型，通过选择性剪接产生。它在正常成人组织中几乎检测不到，但在病理性细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）重塑过程中（包括侵袭性实体瘤）高度表达。这种显著的差异表达使FN-EDB成为一个可靠的肿瘤相关标志物。其积累是肿瘤基质的一个决定性特征，主要与恶性病变的新生血管相关，而在健康组织中持续缺失。这种严格的组织选择性使其成为抗体治疗策略的极具吸引力的靶点。
L19是一种人源单链抗体（scFv），能以高特异性结合FN-EDB，并可将治疗性载荷（包括细胞因子和放射性核素）直接递送至肿瘤，同时保护正常器官。靶向纳米制剂的开发是提高抗肿瘤疗效同时减少副作用的一种有前景的方法。其中，金纳米颗粒（Gold Nanoparticles, AuNPs）因其光学特性（表面等离子体共振效应）和易于与生物分子（如抗体）偶联的特性，在生物成像和生物医学治疗中应用广泛。
光声成像（Photoacoustic Imaging, PA）是一种新兴的非侵入性分子成像技术，结合了光学和超声的优势。它提供高达5 μm的空间分辨率和高达5-6 cm的成像深度，且不使用电离辐射，安全性高。AuNPs是目前最有前景的光声成像造影剂之一，具有诊断和治疗双重应用的潜力。
本研究首次证实了FN-EDB在神经母细胞瘤细胞系来源和患者来源的肿瘤微环境中的表达。此外，研究将AuNPs与L19抗体偶联，并通过光声成像初步证明，L19-AuNP能特异性归巢于表达FN-EDB的神经母细胞瘤患者来源异种移植（Patient-Derived Xenograft, PDX）模型中，为神经母细胞瘤的诊断和未来治疗提供了有前景的平台。
材料与方法
动物模型与样本
研究使用了两种神经母细胞瘤动物模型。一种是细胞系来源的异位模型，将小鼠NXS2细胞系以及人源MYCN单拷贝SH-SY5Y和MYCN扩增IMR-32细胞系注射到小鼠左肾上腺，用于评估FN-EDB的表达。另一种是患者来源异种移植（PDX）模型，将来自两名高危神经母细胞瘤患者的低传代肿瘤片段皮下植入小鼠体内，用于评估FN-EDB表达以及研究L19-AuNP的肿瘤归巢能力。
L19-AuNP的制备与表征
L19抗体（L19-uteroglobin格式）由公司Nano Flow提供，并用于制备L19-AuNP。研究对裸金纳米颗粒（AuNPbare）和L19功能化金纳米颗粒（L19-AuNP）进行了表征，包括流体动力学直径（Hydrodynamic Diameter, HD）、多分散指数（Polydispersity Index, PDI）和Zeta电位。这些参数在纳米颗粒生产后（t0）和储存至少17个月后（t17）均进行了评估。
体外结合特异性验证
通过酶联免疫吸附试验（ELISA）验证了纯化的L19抗体（游离形式和偶联形式）的结合活性。实验使用了包含EDB的阳性抗原（FN7.B.8.9）和不含EDB的阴性抗原（FN7.8.9.10）以及2%牛血清白蛋白（BSA）作为对照。
免疫组织化学（IHC）研究
对冷冻的神经母细胞瘤肿瘤切片进行免疫组织化学染色，使用生物素化的L19抗体检测FN-EDB的表达。
光声成像
在体外，通过光谱模式（Spectro Mode）和Vevo Contrast PHANTOM腔室表征L19-AuNP的吸收光谱，以确定体内检测的最佳波长（684 nm和708 nm）。在体内，对PDX模型小鼠和肿瘤游离小鼠进行光声成像。在静脉注射L19-AuNP后，于基线（注射前）以及注射后6、9和24小时进行图像采集。通过绘制感兴趣区域（Region of Interest, ROI）并计算注射后信号与基线信号的差值（DPA = PAtx- PApre inj）来量化纳米颗粒的积累。
结果
神经母细胞瘤动物模型中FN-EDB的表达
免疫组织化学分析显示，在小鼠NXS2细胞系来源的肿瘤中，FN-EDB呈强阳性表达。在更临床相关的动物模型中，即人源MYCN单拷贝（SH-SY5Y）和MYCN扩增（IMR-32）神经母细胞瘤细胞系异位注射到小鼠体内，这些细胞系来源的肿瘤也表现出对FN-EDB的强阳性。免疫反应信号主要定位于肿瘤血管系统和皮质区域，勾勒出围绕肿瘤细胞的基质沉积轮廓。在患者来源的神经母细胞瘤动物模型（PDX）中，肿瘤显示出与细胞系来源模型相似的FN-EDB分布模式，勾勒出具有血管形成特征的细胞聚集区域。
L19-AuNP的表征
在纳米颗粒生产后（t0），L19-AuNP和AuNPbare均具有足够小的尺寸和均匀的负电荷。与AuNPbare相比，L19-AuNP的直径和Zeta电位增加，表明L19成功修饰在AuNP表面。在储存至少17个月后，在4°C下储存的L19-AuNP表现出优异的时间稳定性，而AuNPbare则表现出PDI和Zeta电位的显著增加，使其不适合用于体内研究。
L19抗体偶联金纳米颗粒的体外结合特异性
ELISA结果显示，游离的L19抗体对靶标FN-EDB具有强且特异的结合活性。在FN7.B.8.9包被的孔中检测到的荧光信号显著高于阴性对照。随后，将L19抗体偶联到AuNPs表面，L19-AuNP在525 nm和540 nm波长下均显示出对FN7.B.8.9包被孔的特异性结合，显著高于阴性对照。相比之下，非功能化的AuNPbare对所有包被的支持物均显示出非特异性结合。这表明L19抗体与AuNPs的偶联保留了其对FN-EDB的选择性识别能力。
L19-AuNP的体内肿瘤积累
在体内实验中，由于AuNPbare稳定性差且体外结合特异性不足，未进行体内测试。研究评估了L19-AuNP在两种表达FN-EDB的神经母细胞瘤PDX模型中的肿瘤靶向能力。结果显示，L19-AuNP在肿瘤中的摄取呈时间依赖性。在FN-EDB表达主要位于肿瘤边缘部分的患者1（pt#1）中，L19-AuNP在注射后9小时达到积累峰值，并保持稳定至24小时。在FN-EDB分布更广泛的患者2（pt#2）中，L19-AuNP的积累在所有分析时间点均远高于pt#1，并在注射后24小时达到峰值。这些结果表明，FN-EDB表达增加与肿瘤归巢增强之间存在特异性相关性。
L19-AuNP的生物分布
在肾脏、肝脏和脾脏中评估了L19-AuNP的生物分布（Biodistribution, BD）特征。结果显示，L19-AuNP在这些非靶器官中的积累可以忽略不计，并且在给药后24小时几乎消失。
讨论
本研究首次证实了纤维连接蛋白B结构域（FN-EDB）在神经母细胞瘤（NB）肿瘤微环境中的表达。研究还表明，功能化L19抗体的金纳米颗粒（L19-AuNP）能够特异性识别FN-EDB，并特异性归巢于神经母细胞瘤患者来源异种移植（PDX）模型中，提示FN-EDB可能作为神经母细胞瘤患者临床环境中的新靶点分子。
FN-EDB的表达在通过异位注射神经母细胞瘤细胞系和植入患者来源异种移植（PDX）获得的神经母细胞瘤模型中均得到证实。研究结果表明，FN-EDB是神经母细胞瘤中持续表达的标志物，尽管水平不同，这可能取决于肿瘤的发展、侵袭性和新生血管形成。本研究采用了L19 scFv与子宫珠蛋白（uteroglobin）融合的格式。子宫珠蛋白是一种小的人源同源二聚体蛋白，具有对pH和温度变化的高耐受性、抗蛋白水解降解和显著溶解度的特点。L19-子宫珠蛋白构建体是一种二价分子，具有优异的溶解度和高稳定性。
由于其强大的肿瘤-基质特异性和在健康组织中的可忽略反应性，L19抗体已成为肿瘤学中广泛使用的靶向配体，用于将成像剂和治疗性载荷直接递送至肿瘤微环境。其稳定性、小尺寸和化学偶联后保持的结合性能使其特别适合用于纳米系统的表面工程。在本研究中，所研究的AuNPs成功与L19偶联，并通过光声成像（PA）测试了其在神经母细胞瘤中的临床潜力。游离L19 Ab和L19-AuNPs的分析结果均证实了其对FN-EDB的结合特异性得以保留。
光声成像（PA）是一种新兴的非侵入性分子成像技术，结合了光学和超声的优势。AuNPs是目前最有前景的光声成像造影剂之一，因其安全性、良好的光学特性和表面等离子体共振效应。在两种皮下神经母细胞瘤PDX模型中，研究证明L19-AuNP在注射后24小时内迅速在肿瘤中积累。此外，观察到注射后L19-AuNP的光声信号强度与相应肿瘤块中FN-EDB的表达量特异性相关，验证了光声成像系统在实验设置中的有效性。相比之下，L19-AuNP在非靶器官中的信号水平要低得多，表明清除率良好。
在本研究中，L19-AuNPs在4°C下储存，而AuNPbare在室温下储存。所有使用的AuNPs在生产后评估时均具有足够小的尺寸和均匀的负电荷。L19-AuNPs在4°C下储存，在尺寸和多分散指数（PDI）方面保持稳定。L19-AuNPs在17个月后负Zeta电位的增加可以通过抗体-纳米颗粒界面的长期稳定动力学来解释。AuNPbare在室温下储存，显示出PDI和Zeta电位的显著增加，这可能是由于纳米颗粒聚集体的存在，因此未在肿瘤归巢和生物分布研究中进行测试。
L19-AuNP的特异性摄取仅在两种神经母细胞瘤PDX模型中得到证实，无疑需要在来自神经母细胞瘤患者的多个样本中得到证实。然而，尽管是初步的，这项研究证明了FN-EDB在来自MYCN单拷贝和MYCN扩增肿瘤的神经母细胞瘤模型的肿瘤微环境中表达，并且在扩增的肿瘤中表达略有优势，提示FN-EDB表达可能成为神经母细胞瘤患者分层的新生物标志物。此外，这项研究证明了FN-EDB是L19功能化AuNP归巢到肿瘤的原因，并且这种选择性靶向随着肿瘤中EDB表达的增加而增加。
这项工作的另一个局限性是没有进行FN-EDB表达的时间依赖性研究。事实上，一个有趣的方面是分析神经母细胞瘤肿瘤在发病、复发或标准治疗期间EDB的表达，以验证该受体是组成性和稳定的标志物，还是仅在疾病的特定阶段表达。
神经母细胞瘤，特别是在难治性或复发病例中，仍然是儿科肿瘤学中的一个重大临床挑战。本研究基于这样的假设：未来开发共载神经母细胞瘤标准治疗药物并功能化L19抗体的金纳米颗粒，可能会增强神经母细胞瘤的诊断、随访和治疗特异性。通过利用AuNP对光声成像的高成像灵敏度，所提出的平台可以提供所提出的纳米系统的实时、非侵入性生物分布和肿瘤归巢，而无需使用目前临床使用的放射性药物，同时将抗肿瘤化合物选择性递送至肿瘤部位。
