《Foods》：Technological Strategies to Enhance the Shelf Life of PDO Tuscan Bread in a Compostable Bag-in-Bag System
可降解袋中袋系统结合改性气氛包装与天然提取物协同延长PDO托斯卡纳面包货架期的新策略
引言
酸面团（sourdough）发酵烘焙食品在过去十年中消费量显著增长，这主要归功于其卓越的健康益处和感官特性。营养学研究表明，酸面团发酵可分解蛋白质，提高其消化率，并释放生物活性肽和氨基酸。此外，酸面团发酵通常能降低血糖生成指数，这部分归因于抗性淀粉的形成。它还能通过提高必需微量营养素的生物利用度来改善面包的营养品质。从技术角度看，酸面团发酵能改善面包风味和质地，降低硬度，并增加面包体积。这些效果与面筋网络的改变以及胞外多糖（exopolysaccharides）的产生有关。酸面团面包的独特风味主要来源于发酵过程中通过氨基酸代谢产生的挥发性化合物，如酯类、醇类和羰基化合物。
意大利拥有200多种手工或传统酸面团面包，其中几种获得了欧盟的地理标志保护（PGI）或原产地命名保护（PDO）认证。托斯卡纳面包（Pane Toscano）就是其中之一，这是一种传统的酸面团产品，以其无盐风味、榛子般香气、开放的面包屑结构、酥脆的外皮和高消化性而闻名。2016年，托斯卡纳面包获得了欧盟委员会颁发的PDO认证，认可了其与产地相关的独特品质。托斯卡纳的特定气候条件影响了小麦的特性，生产出具有理想硬度、W值和P/L值的面粉，适用于制作托斯卡纳面包。这种面包使用酸面团起种发酵未加盐的面粉长达较长时间，赋予其独特的风味、质地和货架期。此外，保留小麦胚芽的传统面粉研磨技术也对其关键质量属性的形成起着至关重要的作用。
面包的货架期主要受真菌腐败和陈化（staling）的限制。酸面团发酵通过减缓淀粉回生（retrogradation）和降低面包屑硬度来延迟陈化，从而带来若干益处。发酵过程中产生的胞外多糖通过增加面包屑水分和减少储存期间的水分流失来促进这种效果。此外，乳酸菌（LAB）产生细菌素（bacteriocins）和抗真菌化合物，如有机酸（乙酸、丙酸、丁酸）和某些二肽，有助于延长货架期。
尽管如此，像托斯卡纳面包这样的手工面包通常比工业面包的货架期短，往往只能保存几天。这种差异源于配方和包装的不同。工业面包通常含有抗真菌剂（如丙酸盐、山梨酸盐）、抗陈化酶（如脂肪酶、淀粉酶）、脂质和乳化剂，这些成分共同延长了货架期。相比之下，手工面包使用的成分较少，通常以无包装或非常简单包装的形式出售。
酸面团发酵提供了一定的天然货架期延长效果，但通常需要额外的策略来进一步保存手工面包。其中一种方法是改性气氛包装（MAP），它降低了包装内的氧气浓度。由于氧气促进需氧腐败微生物的生长并促进氧化反应，降低其浓度是有益的。MAP通常使用二氧化碳，有时与氮气或氩气混合。二氧化碳具有抑菌和抑真菌作用，能改变霉菌的代谢活性、细胞通透性和细胞内pH值。MAP已被证明能有效延长各种类型面包的货架期。
然而，仅靠MAP不足以完全防止真菌（如Endomyces fibuliger和Penicillium commune）的腐败，这些真菌可以在极低的氧气水平下生长。此外，残留的氧气可能从面包本身或随着时间的推移从包装材料中扩散出来，为微生物生长创造有利条件。因此，需要额外的策略，如活性包装（active packaging），以达到理想的货架期。在活性包装系统中，功能性试剂被有意释放到包装中，与食品或其环境相互作用，从而延长货架期。文献中报道的有效活性包装方法包括氧气吸收剂、乙醇发射器和使用天然抗菌提取物的系统。
除了活性和改性气氛包装策略外，包装本身的物理特性在面包保鲜中也起着关键作用。阻隔性能，如氧气、二氧化碳和水蒸气透过率，会影响面包的陈化和微生物生长。在这方面，具有改进阻隔性能的多层包装系统，通过结合不同薄膜层的优点，已被研究用于更好地保存食品。与普通纸袋相比，当面包储存在夹有淀粉-NaCl并向外涂有疏水层的多层纸包装中时，其整体感官品质在储存期间显著改善。改良后的纸包装还减少了储存期间的水分流失和面包硬化。多层包装在延长面包货架期方面的重要性也得到了进一步证明。采用3层LDPE（低密度聚乙烯）薄膜的包装系统在延长微生物货架期方面比使用活性包装（氧气清除剂）和MAP效果更好。
由于对清洁标签（clean-label）食品日益增长的需求以及减少食物浪费的需要，在不使用合成防腐剂的情况下延长烘焙产品的货架期已成为研究人员近年来的主要关注点之一。因此，本研究旨在评估延长托斯卡纳PDO面包货架期的最有效包装策略。测试的策略包括使用二氧化碳气体的改性气氛包装、使用基于天然提取物的芳香顶空配方的活性包装，以及袋中袋（bag-in-bag）系统。
材料与方法
托斯卡纳面包PDO样品（500克）在Corsini Bakery Dolci e Biscotti Srl（位于格罗塞托省Castel del Piano）的生产工厂中重复生产三次，使用来自Molino Angeli Srl（维亚雷焦）的0型小麦粉。用作发酵剂的酸面团起种培养物从托斯卡纳面包PDO协会（阿雷佐）获得，该起种通过每周三次的回溯接种（back-slopping）方式维持。酵母刷新协议如图1所示。对于活性包装处理，面包包装的顶空喷洒了0.5%质量分数的Everfresh? Spray（EVF，一种商业芳香提取物配方，由米兰的Alitaha Srl公司生产，欧洲专利号17,195,461）。该喷雾由天然挥发性化合物混合物组成，主要属于单萜类、含氧单萜类、芳香醛类和酚类衍生物。这些化合物因其气相抗真菌活性而被广泛记载，其作用机制包括破坏真菌膜、抑制孢子萌发和干扰线粒体代谢。由于配方的专有性，确切的定量组成未公开，而其抗菌效果的定性分子组已在专利中描述。活性芳香部分通常包含单萜和含氧单萜（如香茅醛、香叶醇、芳樟醇）、芳香醛（如柠檬醛、肉桂醛型分子）以及与香芹酚/百里香酚家族结构相关的酚类化合物。包装材料由Jolly Plastics S.p.A（皮斯托亚）提供。
储存实验设计
样品根据表1总结的包装测试条件进行组织。每种条件下，将一个500克的面包条进行相应包装。所有实验重复四次。这导致总共八个实验组，如表1所示。该设计允许全面评估包装气氛、包装系统和EVF处理的组合如何影响样品在储存期间延长货架期的能力。在袋中袋包装中，内袋由可堆肥的聚乳酸（PLA）薄膜制成，而外袋由聚对苯二甲酸乙二醇酯/聚乙烯（PET/PE）薄膜组成。
然后将包装放置在温度控制室（型号BPC-150F/IC 150-R Plus, Argo Lab, Carpi, Italy）中，设定温度为20°C，平均环境湿度为55%，以最小化后续货架期评估过程中温度引起的湿度波动。所有样品使用手动热封机（型号SALT30, Propac Srl, Rome, Italy）进行密封。
表2显示了所使用的每种包装材料的具体特性。关于PET/PE和PLA，报告了结构类型、复合层、类型、层厚度、重量、总重量、水蒸气透过率、可堆肥性和熔点。
为了在整个储存期间监测内部条件，在实验开始时直到其货架期结束，每个包装内放置了一个紧凑的、电池供电的传感器设备。这些设备每30分钟自动收集一次数据，记录关键环境参数，如压力（atm）、水蒸气含量（ppmv）、相对湿度（%）和露点（°C）。该系统由微控制器单元（MCU）供电，连接两个数字传感器：SHT30和MS5803-14BA，类似于先前论文中的描述，但经过改进以降低能耗并延长电池寿命，在测量之间处于低功耗睡眠模式。
使用Dansensor CheckPoint? 3（型号CheckPoint? 3, Ametek Srl, Milan, Italy）每日监测顶空氧气和二氧化碳条件，样品重量也每日记录直至货架期结束。货架期定义为从包装到面包表面首次出现可见霉菌生长所需的天数。
面包样品理化特性分析
对这些样品进行理化分析的方法在先前的研究中已有描述，包括：pH值（pH计，AACC标准方法）；总滴定酸度（TTA）；使用快速酶试剂盒（Megazyme Ltd., Bray, Ireland）测定有机酸（D-/L-乳酸、乙酸）；使用HygroPalm HP23-AW-A（Rotronic AG, Bassersdorf, Switzerland）测量水分活度（Aw）。所有测量均进行三次，确保准确评估面包质量，结果如表3所示。
统计分析
所有定量变量（水蒸气含量、相对湿度、露点、氧气和二氧化碳浓度）均经过统计评估，以确定包装条件和储存时间的影响。数据使用双向混合效应ANOVA模型进行分析，其中包装条件作为固定因子，重复作为随机因子以考虑处理内的变异性。当检测到显著的主效应或交互作用时（p < 0.05），使用Tukey's HSD事后检验进行均值分离。使用Shapiro-Wilk检验和Levene's检验分别验证正态性和方差齐性。所有结果以平均值±标准差（n = 4）表示。为确保不同降解阶段的数据一致性，数据被分层为两个时间子集：早期储存（0-5天）和晚期储存（6-18天），因为并非所有包装处理都达到实验期结束。统计计算使用GraphPad Prism v. 9.0.0（GraphPad Software, Boston, MA, USA）进行，模型诊断在R（v. 4.3.1; R Core Team, Vienna, Austria）中验证。货架期数据，定义为出现可见霉菌的时间，被视为右删失的生存数据。构建了Kaplan-Meier生存曲线以可视化每种包装条件下样品保持未腐败的概率。
结果与讨论
面包理化特性
酸面团面包的理化特性因配方和制备方法的不同而有很大差异。包装前（T0）托斯卡纳面包PDO测得的aw、pH、TTA、乳酸和乙酸落在小麦基酸面团面包常见范围内。可比的结果由其他研究报告，在不同起种制备的酸面团面包中，aw范围从0.90到0.81，乙酸水平在0.1234到0.0239 g/100g之间。然而，乳酸含量高于本研究获得的值，范围从0.87224到0.4874 g/100g。希腊中部的传统酸面团面包显示出相似的pH值5.7，但具有更高的TTA（7.9 mL 0.1N NaOH）和aw（0.981）。在通过野生微生物群发酵制成的酸面团中发现了可比的乳酸水平（0.219 g/100g），而在用乳酸菌接种物制备的面包中报告了更高的值（0.259和0.296 g/100g）。酸面团面包中有机酸的存在有助于其低pH值，并支持发酵过程带来的众所周知的延长货架期的效果。
包装内部环境的演变
包装面包的顶空条件，包括水蒸气含量（WVC）、压力、相对湿度（RH）和露点，被监测直到出现可见霉菌生长。进行这些测量是为了评估包装条件如何影响包装面包的内部环境及其与货架期结果的关系。
水蒸气含量
在早期储存期（0-5天），储存时间对WVC有显著影响（p = 0.0243）。事后结果显示仅在T4和C1处理中显著，在特定日期观察到较高的值，而其余包装类型未显示显著变化。在后期储存期（6-18天），储存时间对WVC没有显著影响（p = 0.8532）。这种趋势可能是由于面包基质向顶空的水分迁移有限。或者，可能与包装薄膜的水蒸气透过特性有关，这可能限制了储存期间WVC的显著变化。包装条件对早期储存期（p = 0.0003）和晚期（p = 0.0031）研究的WVC有显著影响。具体而言，在早期储存期，T4表现出显著低于其他包装条件的WVC，而其他包装条件之间的差异不太明显。
相对湿度
储存期间包装食品的水分流失会提高顶空相对湿度。储存时间在储存的早期和晚期阶段都显著影响相对湿度（p < 0.0001）。相对湿度在早期储存期迅速上升，然后在大多数包装条件下逐渐接近稳定状态。这种行为反映了面包的高水分活度（aw = 0.89），这为水分从面包基质迁移到包装顶空提供了驱动力。类似的趋势在部分烘烤的Sangak面包中有报道，其中CO2-MAP下的顶空相对湿度迅速增加到稳定状态（90-95%），显示了顶空相对湿度随时间稳定的一般行为。相比之下，T2和T3在初始储存期显示出相对湿度的急剧下降，在货架期后期达到平衡。包装条件在研究的储存期间显著影响面包顶空的相对湿度（p < 0.0001）。在本研究中，仅当内部相对湿度达到稳定状态后，才在所有样品中观察到可见霉菌生长，这定义了货架期的结束。在单一包装系统中，稳态相对湿度值对可见霉菌发生的影响是明显的：较低的平衡相对湿度值与较长的货架期相关，而较高的稳态相对湿度促进了更早的霉菌生长。例如，货架期最短（6天）的C1也记录了最高的平衡相对湿度（92.370% ± 0.06），高于C3（87.03% ± 0.10）和C4（87.77% ± 0.00）。保持较低的平衡相对湿度对产品货架期有益，因为升高的相对湿度结合微小的温度波动会促进冷凝，从而为微生物生长创造有利条件。袋中袋系统中的相对湿度值和其他顶空测量主要代表PET/PE顶空内的条件，这可能不能完全反映PLA包装内面包周围的环境。这很可能解释了单一包装和袋中袋包装系统之间观察到的差异。
露点温度
露点是表面形成冷凝的温度或低于该温度的温度。时间在头五天内对露点温度没有显著影响（p = 0.4435）。然而，在较长的储存时间（6-18天），观察到时间的显著影响（p < 0.0001），露点向20°C升高，接近储存温度。在C3中，这种增加比其他包装条件更明显。包装条件也对两个储存期的露点有显著影响（p < 0.0001），C3在所有处理中 consistently表现出显著较低的值。
压力
虽然顶空压力可能受到水蒸气、CO2和O2动态的影响，但它也可以作为微生物活动的间接指标，因为气体产生是腐败的常见结果。在本研究中，压力值在不同包装条件和时间上没有显示任何显著变化。
顶空氧气和二氧化碳含量的演变
储存时间对早期（p < 0.0001）和晚期（p < 0.0001）储存期的氧气含量都有显著影响。具体来说，包装面包中的氧气含量在储存期间增加，尽管T1的变化在统计上不显著。包装面包中观察到的氧气增加与之前关于Ciabatta面包在空气和MAP储存条件下氧气消耗的发现形成对比，后者将氧气的减少归因于微生物的氧气消耗。观察到的差异可能源于包装透气性。虽然他们的高阻隔薄膜防止了氧气进入，但本研究中使用的薄膜可能允许更大的氧气传输。这使得持续的氧气渗透成为可能，这可能掩盖了微生物消耗的影响。此外，面包类型和结构的差异也可能起了作用。支持这一解释的是，有报道称白面包在不同氧氮比（5:95, 10:90, 21:79）包装下的顶空氧气是氧气通过低阻隔薄膜渗透和微生物消耗的净结果。此外，酸面团面包内部孔隙的气体释放也可能解释了本研究中观察到的顶空氧气增加。
包装面包的二氧化碳含量在整个储存期间逐渐下降，除了T2。类似的观察在传统Sangak面包中也有报道；研究人员将最初的下降归因于气体溶解在面包中存在的水中，而较长储存时间后的下降则与通过包装材料的渗透有关。T2和T3分别从第9天和第21天开始显示增加，可能反映了微生物活动，与之前关于酸面团面包的发现一致。在CO2-MAP下储存的面包（C3, C4, T3, T4）的二氧化碳含量在前12天没有显著差异。此后，在袋中袋系统（T3和T4）中观察到较低的二氧化碳水平。这些降低的值可能反映了二氧化碳通过PLA层扩散到袋中袋系统内袋中面包的即时顶空。
重量损失
包装面包的重量在整个储存期间波动，观察到一些增加和减少，没有一致的明显趋势。
货架期
包装面包的货架期通过视觉评估进行，定义为直到出现可见霉菌的持续时间。
在空气中且未使用EVF储存的面包样品（C1和T1）表现出最短的货架期，可见霉菌生长在6天后出现。这一结果突出了氧气在促进微生物腐败中的关键作用。在有氧条件下加入EVF（C2和T2）将货架期延长至20天。这证实了天然抗菌剂的气相释放即使在有氧气存在的情况下也能抑制微生物生长。这些发现与先前的报告一致，其中精油蒸气将面包中的霉菌发育延迟了5-15天；在某些情况下，在14天的储存期间完全抑制了真菌生长。这些提取物的活性与其化学成分有关；例如，柠檬草中的橙花醛破坏孢子萌发，而牛至中的香芹酚干扰细胞代谢。
在CO2 MAP下（C3），货架期改善至20天。MAP中CO2的抑制效果有充分记载。这种效果归因于三个主要机制：置换包装顶空中的氧气，溶解到产品的水相中随后形成碳酸导致pH降低，以及直接干扰微生物膜功能和酶系统。类似的CO2驱动的烘焙产品货架期延长已有记载。
当CO2 MAP与EVF结合时（C4），实现了更强的保护效果，将货架期额外延长了8天。这种协同相互作用在黑麦、小麦和无麸质烘焙产品中也得到证实，其中CO2 MAP与精油结合比任一策略单独使用更能有效延迟真菌发育。
重要的是，袋中袋系统在CO2（T3）和CO2 + EVF（T4）条件下进一步增强了霉菌抑制效果，产生了比其单袋对应物（C3和C4）更长的货架期。一个可能的解释涉及袋中袋系统中使用的薄膜的不同气体渗透性特性。具有低CO2渗透性的PET/PE层压材料可能更有效地保持了较高的CO2水平，而具有更高CO2渗透性的PLA层可能允许CO2从外包装逐渐扩散到面包微环境中。这一解释与先前报道的用于本研究的特定薄膜的CO2保留数据一致。PLA薄膜在6天内损失了85.76 ± 22.52%的CO2，而PET/PE仅损失了8.34 ± 8.38%，证实了PLA薄膜的CO2渗透性 substantially greater。
同样可能的是，EVF抗菌挥发物扩散穿过了PLA薄膜，正如一些研究人员所报道的。在包装的新鲜有机野生芝麻菜和糙米的顶空中检测到抗菌挥发物，这些挥发物在通过PLA基抗菌小袋扩散后被发现。在袋中袋配置中，这可能产生单袋系统中不存在的控释效果。这种控释和阻隔功能允许微生物抑制，而无需将面包直接暴露于高浓度的CO2或天然提取物蒸气，这两者都可能对感官特性产生负面影响。升高的CO2可能增加食品的感知酸度，而天然提取物残留物可能损害消费者的接受度。最后，袋中袋系统中的额外PLA层可能通过减少与外部环境的气体交换并缓冲微小的温度或湿度波动，有助于稳定面包周围的微环境。
结论
托斯卡纳面包PDO有限的货架期凸显了对有效保鲜方法的需求。本研究评估了基于CO2的MAP、使用芳香提取物的芳香顶空配方（Everfresh? Spray）的活性包装以及袋中袋系统，以确定它们在延长货架期方面的有效性。
在空气中和未使用EVF储存的托斯卡纳面包PDO货架期最短，袋中袋和单一包装系统均为6天。单独应用EVF由于其抗菌活性，将两种包装系统的货架期进一步延长了14天。当单独应用CO2 MAP条件或与EVF结合应用时，观察到了袋中袋系统的积极效果。具体而言，与它们的单袋对应物相比，袋中袋在单独CO2 MAP和CO2 MAP与EVF结合的情况下，货架期分别增加了12天和13天。PLA作为更具渗透性的内层而PET/PE作为高阻隔外壳的解释与我们之前论文的发现一致，该论文使用基于MCU的监测系统比较了可堆肥和传统的烘焙包装薄膜，并表明可堆肥薄膜（如PLA）在储存期间保持MAP气体成分的效果不如PET或PP基薄膜，表明有效渗透性更高。
这一外部证据支持了此处提出的机械假设，即两种材料的差异气体保留行为有助于袋中袋配置中内部微环境的稳定。
因此，在T3和T4中观察到的延长货架期可以解释为两层互补的阻隔特性的结果，它们共同调节CO2扩散、湿度动态和活性挥发物分布，比任一种材料单独使用更有效。
内部包装气氛受到面包水分迁移、微生物活动、薄膜渗透性（本研究的一个关键局限性）以及所应用的包装条件之间复杂相互作用的强烈影响。尽管袋中袋系统、EVF和基于CO2的MAP的联合应用在延长面包货架期方面显示出相当大的前景，但更详细地了解所涉及的机制需要未来研究使用高阻隔薄膜。这样的薄膜将减少混杂的渗透性效应，并允许更准确地表征水分迁移和微生物活动的动态。在储存期间纳入定量微生物评估、质地分析和感官评估对于全面了解所应用条件的影响也至关重要。
总的来说，这些发现表明，像托斯卡纳面包PDO这样的手工烘焙产品可以使用天然包装策略成功保存，为传统的化学防腐剂提供了消费者友好的替代方案。
