《The Plant Journal》：Targeting the “bitterness gene” by genome editing abolishes synthesis of bitter flavanones in citrus; prospects for new varieties and extended climates for cultivation
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本研究通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术靶向柑橘苦味关键基因——黄烷酮-7-O-葡萄糖苷-1,2-鼠李糖基转移酶（1,2RhaT），成功构建了无苦味柑橘新种质。编辑株系中苦味新橙皮糖苷（如柚皮苷、新橙皮苷）合成被完全抑制，同时无味芦丁糖苷（如橙皮素、香风草苷）代偿性增加，在保留黄酮类化合物健康功效的前提下，为拓展葡萄柚市场及培育抗寒适口柑橘品种开辟新途径。
SUMMARY
柑橘果实的苦味由黄烷酮新橙皮糖苷（flavanone-neohesperidosides）赋予，其积累过程由单一酶——黄烷酮-7-O-葡萄糖苷-1,2-鼠李糖基转移酶（1,2RhaT）催化。为消除苦味，研究团队利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对葡萄柚（Citrus paradisi）和卡里佐枳橙（Citrus sinensis × Citrus trifoliata）的1,2RhaT基因进行定向敲除。编辑株系出现移码突变并引入提前终止密码子，彻底阻断了苦味新橙皮糖苷（柚皮苷、新橙皮苷和枸橘苷）的生物合成。代谢组学分析证实，突变体叶片中苦味黄烷酮新橙皮糖苷完全缺失，而无味黄烷酮芦丁糖苷（橙皮素、香风草苷和柚皮素）代偿性升高。由于1,2RhaT为单基因编码，叶片中的代谢变化预期在果实中一致，该策略为培育无苦味且保留有益黄酮水平的柑橘品种提供了新思路。此外，通过敲除1,2RhaT基因，可使因高含量黄烷酮新橙皮糖苷而无法食用的抗寒柑橘种质转化为有价值的育种材料，从而拓展葡萄柚市场并培育适应更广气候范围的抗寒可口柑橘品种。
INTRODUCTION
苦味感知是人类五种基本味觉机制之一，涉及超过30种苦味受体基因变异，能够识别多种天然毒素。虽然苦味感知具有避免毒素摄入的生存意义，但也导致许多安全且营养的化合物被误判为苦味，限制人群（尤其是儿童）对营养食物的摄入。柑橘苦味主要来源于两类植化物质：黄酮类和三萜类。新鲜果实及鲜榨果汁的“初级苦味”由黄烷酮-7-O-新橙皮糖苷（糖基化黄酮亚群）引起；而果汁暴露于氧气后产生的“次级苦味”则源于柠檬苦素类化合物的氧化。尽管现有脱苦技术可处理果汁苦味，但缺乏对鲜食品种苦味的遗传改良手段。
研究表明，葡萄柚中两种鼠李糖基转移酶（1,2RhaT和1,6RhaT）竞争同一底物——黄烷酮-7-O-葡萄糖苷。1,2RhaT催化苦味新橙皮糖苷（柚皮苷、枸橘苷和新橙皮苷）合成，而1,6RhaT则生成无味芦丁糖苷（柚皮素、香风草苷和橙皮素）。近年研究发现，1,2RhaT是87个柑橘品种苦味的主要决定因子，其功能性等位基因来源于柚（Citrus maxima）。例如，葡萄柚作为橘与柚的杂交后代，继承了柚的苦味特性；而未携带功能性1,2RhaT等位基因的品种（如甜橙和柠檬）则不积累苦味化合物。这表明1,2RhaT在柑橘中为单基因存在，其敲除有望彻底消除果实苦味。
柑橘果实是黄烷酮苷的重要来源，具有抗氧化、抗炎及增强免疫力等健康功效。消除葡萄柚苦味可促进其消费，而卡里佐枳橙作为兼具抗寒性和黄龙病（HLB）耐受性的砧木，为培育新品种提供了重要亲本材料。
RESULTS
柑橘1,2RhaT基因呈单基因存在
通过橘（cv. Ora）与葡萄柚（cv. Hudson）杂交F1群体分析，发现苦味新橙皮糖苷积累与1,2RhaT基因存在完全相关性：不产苦味化合物的橘品种未检测到1,2RhaT条带，而高苦味葡萄柚则显示强条带；F1后代中，产生新橙皮糖苷的个体均携带1,2RhaT基因，反之亦然，证实该基因为单基因遗传。
敲除卡里佐枳橙1,2RhaT基因消除苦味化合物合成
通过农杆菌介导转化约300个卡里佐枳橙上胚轴外植体，获得两个转基因株系CTr34和CTr60。测序显示，两者均在PAM位点下游第4个碱基处插入1个碱基，导致提前终止密码子形成。代谢分析表明，突变体叶片中主要苦味成分枸橘苷完全缺失，柚皮苷和新橙皮苷未检出，而无味芦丁糖苷（柚皮素、香风草苷和橙皮素）水平显著升高。
敲除邓肯葡萄柚1,2RhaT基因实现苦味转化
利用相同gRNA对邓肯葡萄柚进行编辑，获得转基因株系DRT10。该株系同样发生1个碱基插入突变，导致苦味新橙皮糖苷合成中止，而无味芦丁糖苷代偿性增加，总体黄酮水平得以维持。
DISCUSSION
本研究通过基因组编辑成功消除柑橘初级苦味，为培育无苦味葡萄柚品种及利用抗寒种质（如枳橙）开辟了新途径。尽管黄烷酮新橙皮糖苷可能参与植物防御，但其生理功能尚不明确。值得注意的是，不积累该类化合物的柑橘品种（如橘和橙）并未表现出适应性缺陷。编辑株系中苦味化合物的缺失伴随无味芦丁糖苷的显著增加，既保留了黄酮类健康功效，又改善了口感特性。当前研究基于转基因策略，未来通过非转基因编辑技术（如体内编辑）有望推动无苦味柑橘品种的商业化应用。
MATERIALS AND METHODS
实验材料包括五年生橘、葡萄柚及其杂交群体，以及卡里佐枳橙和邓肯葡萄柚种子。通过农杆菌介导法将含有Cas9和靶向1,2RhaT的sgRNA的T-DNA构建体转入柑橘外植体。转基因芽通过微嫁接技术加速成苗。利用特异性引物进行PCR和测序验证编辑效果，采用LC-MS分析黄烷酮苷代谢物含量。
