《Bioengineering & Translational Medicine》：Injectable hyaluronic acid–metformin conjugate gel for sustained intra-articular delivery and prevention of post-traumatic osteoarthritis
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本文开发了一种可注射的透明质酸-二甲双胍（HA-Met）偶联凝胶，用于局部关节内递送以缓解创伤后骨关节炎（PTOA）。研究证实该偶联物可实现二甲双胍的长期关节内滞留，并在小鼠PTOA模型中显示出优于单独使用HA或Met的软骨保护作用，为关节疾病的干预提供了具有转化潜力的新型递送平台。
可注射透明质酸-二甲双胍偶联凝胶的研发与评价
引言
骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种退行性关节疾病，病理特征包括软骨损伤、骨赘形成和滑膜炎。创伤后骨关节炎（Post-Traumatic Osteoarthritis, PTOA）是关节损伤后常见的严重后果，尤其在年轻和活跃个体中高发，而目前的治疗手段大多仅为姑息疗法。透明质酸（Hyaluronic Acid, HA）是一种天然存在的生物相容性多糖，广泛存在于关节软骨和滑液中。临床上，HA被批准用于轻度OA的关节内注射，以恢复润滑、减少摩擦并改善关节活动度。然而，单独使用HA仅能提供短暂的症状缓解，并不能显著改变OA的病程。
二甲双胍（Metformin, Met）是一种广泛使用的抗糖尿病药物，近年来因其在肌肉骨骼疾病（包括OA）中的治疗潜力而受到关注。Met作为AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）的激活剂，在OA大鼠模型中已显示出抗炎能力。临床前研究表明，Met具有抗炎、抗纤维化和软骨保护特性，可减轻软骨降解、抑制成纤维细胞活化并调节伤害性信号通路。然而，Met的全身给药因其快速清除、脱靶分布以及由于其短血浆半衰期（5–6小时）而需要频繁给药受到限制。
为了克服这些局限性，本研究开发了一种新型的HA-Met偶联凝胶，设计用于关节内注射，以向受损关节提供局部、持续的Met递送。通过将Met与HA共价连接，该制剂整合了HA的结构和润滑益处与Met的抗炎活性，形成了一个双功能治疗平台。这种化学偶联增强了药物在关节内的滞留，提高了局部生物利用度，并减少了全身暴露。
材料与方法
HA-Met偶联水凝胶的合成如支持信息图S1所示。将透明质酸钠（200 mg, 1500 kDa）溶解于20 mL蒸馏水中（10 mg/mL），随后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC, 10 mg）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS, 12.5 mg）。将混合物搅拌30分钟，然后加入盐酸二甲双胍（800 mg；最终浓度40 mg/mL）并在室温下搅拌过夜。第二天，加入20 mL丙酮，通过离心（2000 rpm, 10分钟）收集所得白色固体，用2 mL去离子水洗涤，并在50°C下干燥过夜。将干燥的偶联物重新溶解在去离子水中，制备HA-Met偶联水凝胶以供进一步使用。
采用傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy, FT-IR）、质子核磁共振光谱（Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy, 1H NMR）和高效液相色谱（High-performance liquid chromatography, HPLC）验证HA与Met的偶联。通过体外释放实验评估HA-Met偶联物的释放动力学。将1 mL HA-Met偶联凝胶（含HA 10 mg, Met 40 mg）或HA（10 mg）与Met（40 mg）的物理混合物置于截留分子量为7000 Da的透析袋中，浸入14 mL磷酸盐缓冲液（Phosphate-Buffered Saline, PBS）中，并在37°C水浴中孵育。在不同时间点收集外部PBS溶液样品，通过HPLC定量Met浓度。
所有动物实验程序均符合动物研究：体内实验报告（Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments, ARRIVE）指南，并获匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC）批准（协议号#23022576）。使用8周龄雌性C57BL/6J小鼠。通过内侧半月板失稳（Destabilization of Medial Meniscus, DMM）手术诱导小鼠膝关节PTOA模型。手术后，将小鼠随机分为6组（每组n=15）：假手术组（Group 1）、DMM组（Group 2，横断但不治疗）、以及从术后1周开始每周接受关节内注射（10 μL）的盐水组（Saline, Sal, Group 3）、HA组（Group 4, 10 mg/mL）、Met组（Group 5, 40 mg/mL）和HA-Met偶联物组（Group 6, 10 mg HA with 40 mg Met/mL）。在术后4、8和12周，处死每组5只小鼠进行关节组织分析。
对小鼠膝关节组织进行组织学处理，包括苏木精和伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色、萨夫拉素O和固绿（Safranin O and Fast Green, SFO&FG）染色以及马松三色（Masson's Trichrome, MT）染色。由三名独立的、设盲的研究人员使用骨关节炎研究学会国际（Osteoarthritis Research Society International, OARSI）评分系统（0-6分）对胫骨平台和股骨髁区域进行组织病理学评估。
使用Python（v3.11）中的SciPy和statsmodels进行统计分析。对于关节内Met浓度，采用单因素方差分析（One-way analysis of variance, ANOVA）比较不同时间点（第1-4周）的差异，并进行Tukey事后检验。OARSI评分采用非参数方法（Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U检验）进行比较，并使用Benjamini-Hochberg错误发现率（False Discovery Rate, FDR）校正进行多重比较。显著性水平设定为FDR校正后的p < 0.05。
结果
HA-Met偶联的验证
FT-IR分析证实了HA与Met的成功偶联。HA-Met偶联物的FT-IR光谱在1625 cm-1处出现了一个新峰，对应于HA的羧基与Met的伯胺基之间形成的酰胺键（O=C–N）。此外，Met光谱中涉及N-H键的1556 cm-1峰在HA-Met偶联物光谱中移至1562 cm-1，表明形成了酰胺键。
1H NMR光谱进一步支持了化学偶联。在HA-Met偶联物的光谱中，化学位移与单独的HA和Met光谱不同，表明由于偶联导致质子环境改变。特别值得注意的是，在~6.10和~6.90 ppm处出现了两个新的低场峰，后者可能代表偶联反应新形成的酰胺质子（–O=C–NH–），证实了HA和Met的成功连接。
HPLC分析显示，纯HA在约1.5分钟处有一个主峰，而Met在约2.6分钟处有一个峰。在HA-Met偶联物样品中，游离HA峰（保留时间Retention Time, RT 1.5分钟）消失，并在约2.4和2.8分钟处出现了新的峰，对应于不同分子量的HA-Met偶联物。HA + Met物理混合物的色谱图则只是两个单独峰的重叠，没有观察到偶联物样品中的额外峰。
体外稳定性
HA-Met凝胶在去离子水中溶解后形成透明、粘稠的溶液。稳定性测试表明，在37°C生理条件下孵育28天，凝胶中约40%的Met（对应于偶联物中未结合的Met）在第一天被检测到，并且该浓度在28天内保持恒定，显示出优异的体外稳定性。当凝胶经受热应力（100°C, 12小时）时，>72%的Met被释放到溶液中。相比之下，HA + Met物理混合物在3天内几乎完全释放。这些结果表明，HA-Met偶联凝胶在生理条件下高度稳定，仅在长时间煮沸才会诱导部分偶联物降解。在含有透明质酸酶（每日添加200或100 U/mL）的PBS中，HA-Met偶联凝胶中的Met在4天内持续释放。
体内Met滞留
给予小鼠每周关节内注射HA-Met偶联凝胶后，膝关节组织中滞留的Met量随时间推移逐渐增加，从第一次注射后1周的7.6 ng/mg组织，增加到第二次、第三次和第四次注射后的9.7、20.9和32.6 ng/mg组织。相比之下，注射Met溶液或HA + Met混合物后，膝关节中滞留的Met量在每个时间点都几乎相似，并且在注射后迅速下降：1小时为141.49和145.74 ng/mg，6小时为82.48和99.74 ng/mg，1天为3.45和5.43 ng/mg，2天为0.71和1.74 ng/mg，3天为0和0.06 ng/mg。单因素方差分析显示时间对组织药物浓度有显著影响（p < 0.0001）。事后Tukey HSD检验发现，第4周时的Met水平显著高于第1周（p < 0.001）、第2周（p < 0.001）和第3周（p = 0.02）；第3周时的水平也显著高于第1周（p = 0.004）和第2周（p = 0.012）；第1周和第2周之间无显著差异（p > 0.05）。这些发现证实HA-Met凝胶能够实现Met在关节组织中的持续和随时间依赖的滞留，峰值水平在注射后4周达到。
HA-Met偶联凝胶注射减轻PTOA发展
组织学染色（H&E、MT、SFO&FG）结果显示，假手术组在所有时间点均保持正常的软骨结构、厚度和软骨下骨，无病理变化。DMM组和盐水组在所有时间点均显示出典型的骨关节炎变化，包括软骨粗糙、裂隙、深层侵蚀至软骨下骨、关节间隙增宽和变形，验证了PTOA模型的有效性。HA单独治疗组和Met单独治疗组也显示出PTOA的发展和进展，但程度较DMM组和盐水组轻，表明具有部分保护作用。然而，到12周时，HA组和Met组仍出现明显的软骨侵蚀和关节间隙改变。相比之下，HA-Met偶联凝胶注射组显示出接近正常的软骨结构保存，仅有轻微的软骨纤维颤动和表面蛋白聚糖丢失，以及一些微小的软骨裂隙，表明HA-Met凝胶在预防PTOA进展方面的有效性。
OARSI评分分析结果与组织学观察一致。假手术组在所有时间点评分均为0。DMM组和盐水组的OARSI评分在4、8、12周时分别为4.8、8.7、11.0和5.3、9.0、11.3，表明进行性病理变化。HA组的评分分别为3.5、4.2、7.3，Met组分别为3.7、5.5、7.7，略低于DMM组和盐水组。相比之下，HA-Met组的评分从4周时的0.91，增加到8周时的2.5和12周时的4.3，显著低于其他治疗组（除假手术组外）。Mann-Whitney U检验显示，在所有三个时间点，HA-Met治疗组的OARSI评分均显著低于DMM组（FDR校正后p < 0.001）。与HA或Met单药治疗相比，HA-Met治疗在4周（p = 0.0057）、8周（p = 0.0089和p = 0.0057）和12周（p = 0.0065和p = 0.0127）也显示出显著改善的结果。HA组和Met组在4周和8周时的评分显著低于DMM组（均p < 0.001），但在12周时与DMM组无显著差异（HA vs. DMM: p = 0.0547; Met vs. DMM: p = 0.0570）。
股骨髁和胫骨平台软骨厚度的半定量分析进一步支持了上述结果。与假手术组相比，HA-Met组仅显示软骨厚度轻微下降，而DMM、盐水、HA和Met组则表现出显著的进行性软骨丢失。
讨论
本研究开发了一种可注射的HA-Met偶联凝胶，并证明了其作为局部关节内递送平台的潜力，能够延长Met在关节组织中的滞留和稳定性。尽管使用PTOA作为概念验证的适应症，但其更广泛的意义在于药物递送设计：将Met与HA共价结合能够实现靶向关节内暴露，同时限制全身分布。
与传统的关节内注射或全身药理方法相比，这种HA-Met偶联物具有几个潜在优势：局部给药降低了全身不良反应的风险；延长的局部滞留可能减少与游离药物相比的注射频率；HA介导的关节支持与Met的抗炎活性相结合可能提供双重作用保护。
这项工作存在一些局限性，为未来的研究指明了方向。首先，虽然在体外比较了偶联与非偶联（HA + Met混合物）制剂，发现游离Met相对于偶联物释放/清除更快，但在体内疗效研究中未包含HA + Met混合物对照组；未来的疗效研究将纳入该对照组以直接验证益处是否归因于偶联。其次，未评估凝胶的力学/流变学性质；这些材料表征对于优化和转化非常重要。第三，未评估长期孵育后Met的生物活性；后续研究将把长期释放与功能读数结合起来。其他考虑因素包括使用雌性小鼠而未进行动情周期分期（通过随机化跨周期阶段来缓解）、DMM手术模型固有的局限性以及需要扩展的机制分析（如细胞因子信号、氧化应激和ECM重塑）。
展望未来，关键的转化步骤包括确定剂量范围和持久性研究以确定暴露量和滞留时间、优化给药频率、在两种性别和相关激素状态（如绝经后）中确认疗效，以及在大型动物模型中进行评估。制造目标包括开发具有验证稳定性/灭菌参数的无菌、单次使用制剂，然后进行良好实验室规范（Good Laboratory Practice, GLP）毒理学研究以支持监管申报。总的来说，这些努力将决定HA-Met偶联凝胶是否能提供一种实用、可扩展的方法，以在高风险患者关节损伤后延迟或预防PTOA的进展。
作者贡献与致谢
Vasyl Pastukh负责初稿撰写、研究、数据整理、形式分析和验证。Jianying Zhang和Soichi Hattori负责方法学、数据整理和验证。Susheng Tan、Satyaj Bhargava和Derek Maloney负责方法学和研究。MaCalus V. Hogan负责审稿和编辑。James H-C. Wang负责概念化、项目管理、方法学、验证、资源、审稿、编辑和监督。
作者感谢Bhavani P. Thampatty在稿件准备方面的协助。本研究部分由美国国防部/医疗技术企业联盟（Department of Defense/Medical Technology Enterprise Consortium, DOD/MTEC）奖项W81XWH2290016和DOD HT9425-23-1-0617支持。作者声明无利益冲突。支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。
