《Cell Death & Disease》：PIM kinase inhibition attenuates pro-tumoral and immunosuppressive functions of macrophages in classic Hodgkin lymphoma
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本研究针对经典霍奇金淋巴瘤(cHL)中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)促进免疫抑制微环境形成的机制难题，通过单细胞测序(CITE-seq)与体外模型揭示了RS细胞通过诱导PIM激酶表达驱动TAM向促肿瘤表型极化。研究发现泛PIM抑制剂MEN1703可逆转TAM的免疫抑制功能，抑制Treg分化、血管生成及细胞外基质重塑，为联合免疫检查点抑制剂治疗cHL提供了新策略。
在经典霍奇金淋巴瘤（classic Hodgkin lymphoma, cHL）的肿瘤微环境中，少数恶性的Reed-Sternberg（RS）细胞能够巧妙地躲避免疫系统的攻击，并招募大量正常的免疫细胞为其“服务”。其中，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）被认为是RS细胞的“帮凶”，它们通过多种机制促进肿瘤生长、抑制抗肿瘤免疫，并与患者较差的预后密切相关。尽管靶向PD-1的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）对部分cHL患者有效，但仍有相当一部分患者会出现原发性耐药或治疗后复发，这表明肿瘤免疫逃逸的机制远比我们已知的更为复杂。因此，深入揭示TAMs在cHL中如何被“教唆”成促肿瘤表型，并寻找其关键弱点，对于开发新的联合治疗策略至关重要。
此前的研究表明，PIM激酶（PIM1, PIM2, PIM3）在RS细胞中高表达，并参与其生存和免疫逃逸。然而，PIM激酶在cHL的TAMs中是否表达、有何功能，尚属未知。发表在《Cell Death & Disease》上的这项研究，由Maciej Szydowski等人完成，他们综合利用前沿的单细胞多组学技术和功能实验，首次系统地揭示了PIM激酶是连接RS细胞与TAMs的关键信号枢纽，抑制PIM激酶能够显著削弱TAMs的促肿瘤和免疫抑制功能，为cHL的治疗提供了新的靶点和思路。
为开展本研究，研究人员主要运用了几项关键技术：首先，他们对9例初治cHL患者和对照组织的活检样本进行了 Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing（CITE-seq，可同时检测单细胞转录组和细胞表面蛋白），以在单细胞水平解析肿瘤免疫微环境；其次，他们建立了体外TAM模型，通过将单核细胞或THP1细胞来源的巨噬细胞与RS细胞系（L1236, L428）进行非接触共培养，模拟体内TAM的极化过程；此外，研究还采用了临床级别的泛PIM激酶抑制剂MEN1703（dapolsertib）以及PIM特异性蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）进行药理干预，并通过流式细胞术、免疫印迹、蛋白质芯片、代谢分析以及一系列功能实验（如血管生成实验、胶原吞噬实验、嗜酸性粒细胞趋化实验和Treg分化实验）来评估PIM抑制的效果；最后，他们还在免疫缺陷（NSG）小鼠的RS细胞异种移植模型中验证了PIM抑制对巨噬细胞肿瘤浸润的影响。
PIM激酶在cHL肿瘤相关巨噬细胞中表达
通过对患者样本的CITE-seq分析，研究人员成功鉴定了cHL肿瘤微环境中的各种免疫细胞群体，其中包括一个包含单核细胞、巨噬细胞和常规树突状细胞的髓系细胞簇（M/M/cDC cluster）。与正常反应性淋巴组织（reactive lymphoid tissue, RLT）中的巨噬细胞相比，cHL来源的巨噬细胞表达谱发生了显著改变，呈现出典型的M2样巨噬细胞特征，并且高表达包括CD274（PD-L1）、IDO1（吲哚胺2,3-双加氧酶1）以及PIM1和PIM3激酶在内的多个免疫调节分子。免疫荧光染色进一步在蛋白水平证实了CD68阳性的TAMs确实表达PIM1/2/3激酶，这提示PIM激酶可能在TAM的功能中扮演重要角色。
cHL TAM体外模型的建立与表征
由于原代TAM难以进行体外功能研究，研究人员构建了体外TAM模型。他们将单核来源或THP1来源的巨噬细胞（M0）与RS细胞进行非接触共培养，获得了RS细胞驯化的巨噬细胞（RS-educated macrophages, RS-M）。这些RS-M在表型上高表达TAM相关的标志物如CD163、CD206、CD209和PD-L1。转录组分析显示，RS-M的基因表达特征与经典的M2型巨噬细胞高度相似，并且显著富集了在原发性cHL TAMs中高表达的基因签名。此外，RS-M还分泌大量的细胞因子和趋化因子（如CCL2、CCL17、IL-6、IL-8、MMP9等），参与血管生成、细胞外基质重塑和免疫细胞招募，并发生了显著的代谢重编程。这些结果表明，该体外模型成功地模拟了原发性cHL TAMs的关键特征。
PIM激酶参与RS细胞诱导的TAM表型发育
接下来，研究人员探究了PIM激酶在TAM极化过程中的作用。他们发现在巨噬细胞与RS细胞共培养时，加入泛PIM抑制剂MEN1703或PIM447，可以抑制M2相关转录因子CREB1、STAT3和STAT6的磷酸化（活化）。同时，PIM抑制剂也显著减弱了RS细胞诱导的CD163、CD206、CD209和PD-L1等TAM特征性表面分子的表达，并抑制了IL-6、IL-8、CCL2、CCL17和MMP9等促肿瘤因子的分泌。在动物实验中，使用MEN1703治疗携带L428 RS细胞肿瘤的NSG小鼠后，肿瘤组织内浸润的单核/巨噬细胞数量明显减少。这些结果说明，PIM激酶的活性对于RS细胞招募巨噬细胞并诱导其向促肿瘤表型极化是必需的。
PIM激酶维持cHL中巨噬细胞的促肿瘤表型
更为重要的是，研究团队想知道对于已经极化的TAMs，抑制PIM激酶是否能逆转其功能。他们将已经与RS细胞共培养成熟的RS-M分离出来，再用PIM抑制剂处理。结果显示，PIM抑制能够显著下调RS-M中由RS细胞诱导上调的基因表达，这些基因涉及先天免疫反应、血管生成、微环境重塑等多个方面。在表型上，PIM抑制降低了RS-M表面CD163、PD-L1、CD206、CD209和CD86的表达，并持续抑制了CREB、STAT3和STAT6的活性。同时，RS-M的糖酵解和线粒体呼吸等代谢活性也被削弱，其分泌IL-6、CCL17、IL-8、CCL2、MMP9、TGF-β、IDO1和IL4I1（IL4诱导的免疫调节分子）的能力大幅下降。使用PIM特异性PROTAC降解PIM蛋白也得到了类似的结果。这表明，PIM激酶不仅参与TAM的极化过程，更是维持其成熟促肿瘤功能的关键开关。
PIM抑制减弱TAM的促肿瘤功能
基于上述发现，研究人员进一步评估了PIM抑制对TAM具体功能的影响。他们发现，经PIM抑制剂处理的RS-M，其条件培养基诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）形成血管小管的能力显著减弱；在体实验也显示，MEN1703治疗组小鼠肿瘤内的CD34阳性血管密度更低。此外，PIM抑制还降低了RS-M对细胞外胶原的吞噬能力，以及其招募嗜酸性粒细胞迁移的能力。最后，在一个关键的免疫调节功能实验中，RS-M的条件培养基能够有效地促进初始CD4+T细胞分化为CD25+FOXP3+的调节性T细胞（Treg），而用PIM抑制剂预处理RS-M后，其培养基诱导Treg分化的能力则被基本废除。这些功能实验从多个层面证实了PIM抑制能够有效瓦解TAM支持肿瘤生长和免疫逃逸的核心能力。
研究结论与意义
综上所述，这项研究深入揭示了PIM激酶在cHL肿瘤微环境中扮演的一个全新而核心的角色：它不仅是恶性RS细胞生存和免疫逃逸的驱动因子，也是RS细胞与TAMs之间恶性通信的关键枢纽。PIM激酶在TAMs中的表达和活化，驱动了其向促肿瘤、免疫抑制状态的极化和功能维持。药理学的PIM激酶抑制（使用MEN1703）或蛋白降解，能够从多个维度攻击cHL的防御体系：直接诱导RS细胞死亡；抑制RS细胞分泌招募和极化巨噬细胞的因子；逆转已极化TAM的免疫抑制表型，减少其免疫检查点分子（如PD-L1）、免疫抑制酶（IDO1, IL4I1）和促血管生成、促组织重塑因子的表达；最终削弱TAM介导的血管生成、基质重塑、嗜酸性粒细胞招募和Treg诱导等关键促肿瘤活动。
该研究的发现具有重要的临床转化意义。它强有力地支持了将PIM激酶抑制剂（如MEN1703/dapolsertib）与现有的免疫检查点抑制剂联合使用，作为cHL的一种潜在治疗策略。这种联合疗法有望通过同时靶向肿瘤细胞（RS细胞）和其关键的免疫抑制“帮凶”（TAMs），更彻底地瓦解肿瘤的免疫抑制屏障，从而可能克服当前免疫疗法面临的耐药性问题，为更多cHL患者带来希望。尽管该研究在完全模拟人体内复杂免疫相互作用的动物模型方面存在局限，但其提供的坚实临床前证据，为后续的临床试验奠定了坚实的基础。
