解析DSPE-PEG2000在体内的命运及其与生物大分子的相互作用

《Journal of Controlled Release》：Deciphering the in vivo fate and biomacromolecular interactions of DSPE-PEG2000

基于LC-Q-TOF MS和抗PEG-scFv技术开发了DSPE-PEG2000的精准分析体系，揭示了其在体内的代谢动力学特征（肺、肝、脾组织特异性分布）、补体激活机制、代谢产物（DSPE/PEG2000）的排泄途径，以及与血浆蛋白的竞争性结合（PPB 63.2±7.11%），证实其非完全生物惰性并建立载体安全性评估新范式。

　　

作者：蔡德奇（Deqi Cai）、苏崇（Chong Su）、赵明阳（Mingyang Zhao）、杨焕（Huan Yang）、张哲（Zhe Zhang）、刘英泽（Yingze Liu）、顾景凯（Jingkai Gu）

中国吉林省长春市吉林大学化学学院超分子结构与材料国家重点实验室，邮编130012

摘要

DSPE-PEG2000（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-聚乙二醇-2000）是一种关键的辅料，用于Doxil?等隐形纳米制剂中，通过形成空间位阻亲水屏障来延长纳米载体的血液停留时间。然而，其被认为的生物惰性面临着新的PEG相关风险的挑战。由于分析方法的限制，其体内的命运和生物大分子相互作用尚未得到充分研究。本文创新性地采用了液相色谱-四极杆/飞行时间质谱（LC-Q-TOF MS）技术和抗PEG单链可变片段（PEG-scFv）策略，来解析DSPE-PEG2000在静脉注射后的生物特性。研究结果表明：DSPE-PEG2000在血浆中的半衰期较短，主要分布于肺、肝和脾脏组织；可激活补体系统但不会引发适应性抗体反应；会分解为DSPE和PEG2000成分并通过肾脏排出；其血浆蛋白结合率为63.2±7.11%，能够竞争性地取代50%的多柔比星（doxorubicin）与血浆蛋白的结合位点。这些发现揭示了DSPE-PEG2000的非惰性特性，包括组织特异性分布、先天免疫激活、复杂的代谢过程以及与血浆蛋白的相互作用，从而突显了其潜在的安全风险。本文开发的创新方法为聚合物追踪提供了范例，并为辅料的安全评估和优化提供了重要见解。

引言

DSPE-PEG2000（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-聚乙二醇-2000）是构建聚乙二醇化长循环脂质体的关键纳米载体材料。自1995年首次应用于Doxil?（美国食品药品监督管理局（FDA）批准的第一个脂质体药物）以来，它已被扩展到多种FDA批准的制剂中，如Onivyde?和LipoDox?。DSPE-PEG2000包含一个疏水的DSPE结构域，可以稳定地锚定在磷脂双层中，以及一个亲水的PEG2000段，可在脂质体表面形成保护性的水化屏障，从而减少蛋白质吸附并降低单核吞噬细胞系统的识别，从而延长脂质体的血液循环时间。这使得DSPE-PEG2000在脂质体抗肿瘤递送系统中变得不可或缺。

作为外源性功能性辅料，DSPE-PEG200在脂质体制剂中的含量相当可观。长期以来，PEG或聚乙二醇-脂质（PEG-lipid）一直被认为是一种惰性物质，仅通过物理空间位阻发挥作用。然而，新的证据表明PEG可以在体内诱导抗PEG抗体，引发过敏反应、输注反应和加速血液清除等免疫相关不良反应。此外，某些PEG聚合物还可能表现出器官特异性毒性，如肾毒性（表现为肾小管上皮细胞肿胀和空泡变性），以及在非肾脏器官（脾脏、淋巴结、肺、卵巢/睾丸）中的剂量依赖性空泡化，并能穿透血脑屏障（BBB）分布到中枢神经系统。还有一些PEG化物质能够抑制关键的药物代谢酶（如细胞色素P450，CYP450）的活性。

为应对这些风险，FDA、欧洲药品管理局（EMA）和中国的国家药品监督管理局（CDE）的监管指南明确要求评估载体的器官积累和免疫原性风险，并在必要时进行载体材料的药代动力学研究，以明确载体对释放药物药代动力学（PK）的影响。因此，阐明DSPE-PEG2000的生物特性不仅有助于深入理解纳米制剂中关键PEG-脂质成分的作用机制，也是确保符合监管要求（FDA/EMA/CDE）评估载体相关毒性和药代动力学的重要前提。

然而，DSPE-PEG2000的多分散性和复杂的同系化合物比例给分析表征带来了困难。为此，我们开发了一种基于MS^ALL模式的液相色谱-三极杆/飞行时间质谱（LC-Q-TOF MS）方法，用于复杂生物基质中DSPE-PEG2000及其PEG代谢物的精确定量，并创新性地使用了抗PEG单链可变片段（PEG-scFv）技术来测定其血浆蛋白结合率。通过这些方法，我们系统地研究了DSPE-PEG2000的体内命运，包括血液循环动力学、组织分布模式、代谢途径和排泄过程，以及其与血浆蛋白（在大鼠和人类中）和CYP450酶的相互作用。我们还探讨了DSPE-PEG2000引起的免疫原性和炎症反应，并评估了其对游离多柔比星（DOX）血浆蛋白结合率的影响，揭示了PEG-脂质辅料如何通过与血浆蛋白的动态相互作用调节药物行为。这项研究加深了对DSPE-PEG2000生物行为的理解，并为纳米疗法中的辅料安全性评估提供了可移植的框架，有助于设计出更具预测性和效率的下一代聚乙二醇化纳米载体。

试剂与材料

DSPE-PEG2000（由中国上海A.V.T.生物制药技术有限公司提供）；内标二苯海拉明（由中国国家食品药品监督管理局提供）；PEG2000（由中国科学院长春应用化学研究所提供）；O,O-二甲基-O-2,2-二氯乙烯基磷酸酯（DDVP）（来自美国密苏里州圣路易斯的Sigma–Aldrich公司）；异丙醇（HPLC级）、甲酸和醋酸铵（由中国上海新华制药试剂有限公司提供）；乙腈（HPLC级）。

DSPE-PEG2000和PEG2000的LC-Q-TOF MS方法开发

传统的放射性标记技术因其高灵敏度而被广泛认为是生物分布研究的金标准，但它们在特异性方面存在显著局限。放射性标记往往无法区分完整的脂质-聚合物结合物及其裂解代谢物（例如游离的PEG），因为它们仅依赖于信号强度而非分子结构。此外，放射性标记物在体内的脱落也可能影响研究结果。

结论

聚乙二醇（PEG）-脂质（如DSPE-PEG2000）是纳米医学中的关键成分，广泛用于提高脂质体制剂的稳定性并通过增强渗透性和保留效应（EPR）促进肿瘤靶向。尽管在过去三十年中得到了广泛应用，但关于其在体内的行为仍存在许多未知之处，这主要是由于对其生物惰性的普遍假设和技术挑战。

作者贡献

本手稿由蔡德奇和苏崇共同撰写。所有作者均已批准最终版本。

CRediT作者贡献声明

蔡德奇：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、软件使用、实验设计、数据分析、结果整理。

苏崇：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、软件使用、实验设计、数据分析、结果整理。 赵明阳：数据验证。 杨焕：数据整理。 张哲：数据可视化、软件使用、数据整理。

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82030107、82304443、82373944）的财政支持。我们衷心感谢詹长友教授和刘世勇教授在本研究过程中的专业指导和坚定支持。