哈尔滨干香肠中腐生葡萄球菌蛋白酶的发酵潜力：蛋白质水解、风味分析及分子对接研究

《Meat Science》：Fermentation potential of Staphylococcus saprophyticus protease in Harbin dry sausages: Protein hydrolysis, flavor profiling, and molecular docking

本研究的发酵潜力及风味形成机制，通过代谢组学、气相色谱-质谱联用和分子对接技术，发现Staphylococcus saprophyticus蛋白酶显著降低肌动蛋白重链、磷酸化酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达，同时增加肌动蛋白轻链，并减少酰胺A/B/I/II带强度，导致α螺旋和随机卷曲含量增加（P<0.05）。共鉴定325种差异代谢物和9种关键挥发性化合物，其中滋味肽、氨基酸及其衍生物、酸、酮类和酯类比例显著提升，脂质氧化适度抑制。蛋白质消化、氨基酸生物合成及代谢通路是三条主要富集途径，分子对接显示氢键为蛋白酶与目标蛋白的主要作用方式。最佳酶添加量为1.6g/kg，显著改善pH（5.38）、水分活性和感官评分，优于直接接种该菌。

　　

范宇航|孙方达|陈倩|刘倩|刘浩天|孔宝华

中国黑龙江省哈尔滨市东北农业大学食品科学学院，邮编150030

摘要

本研究结合了代谢组学、气相色谱-质谱技术和分子对接方法，探讨了腐败葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）蛋白酶在哈尔滨干香肠中的发酵潜力及其风味形成机制。凝胶电泳结果显示，腐败葡萄球菌蛋白酶显著降低了肌球蛋白重链、磷酸化酶和甘油醛脱氢酶的条带强度，同时增加了肌球蛋白轻链的条带强度。傅里叶变换红外光谱分析表明，添加蛋白酶后酰胺A、B、I和II带的强度降低。二级结构分析显示，α-螺旋和无规卷曲结构含量增加，而β-折叠和β-转角结构含量减少（P < 0.05）。在香肠样本中鉴定出325种差异代谢物和9种关键挥发性化合物。具体而言，腐败葡萄球菌蛋白酶促进了风味肽、氨基酸及其衍生物、酸类、酮类和酯类的增加，同时适度抑制了脂质氧化。蛋白质消化与吸收、氨基酰-tRNA生物合成以及氨基酸生物合成是三个最显著的代谢途径。分子对接结果表明，氢键是腐败葡萄球菌蛋白酶与其靶蛋白（肌球蛋白重链和磷酸化酶）之间的主要相互作用方式。此外，香肠的pH值、水分活度、剪切力和感官评分均显著改善（P < 0.05）。随着蛋白酶添加量的增加，水解活性和产品质量均表现出浓度依赖性增强。当腐败葡萄球菌蛋白酶的添加量为1.6 g/kg时，获得了最佳的产品质量，这优于直接接种腐败葡萄球菌的效果。

引言

风味是发酵肉制品的关键质量属性，与微生物代谢活动密切相关（Dong, Liu, He, Li, & Zhu, 2025）。风味的发展主要涉及三条微生物代谢途径：氨基酸分解代谢、脂肪酸代谢和碳水化合物代谢（Fan et al., 2025）。随着发酵的进行，蛋白质水解和氨基酸代谢越来越依赖于微生物活动，尤其是蛋白酶的分泌（Sun et al., 2023）。微生物蛋白酶通过离子键、氢键和疏水相互作用与底物蛋白结合，使催化活性位点能够结合底物并形成酶-底物复合物。这种相互作用降低了肽键断裂所需的活化能，加速了蛋白质降解。根据催化活性位点的特性，蛋白酶被分为天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。其中包括内肽酶（切割内部肽键生成寡肽）和外肽酶（水解肽的N端或C端释放游离氨基酸，FAA）（Fan et al., 2025）。研究蛋白酶的分析方法已经成熟，主要的纯化技术包括快速蛋白质液相色谱、高效液相色谱和疏水相互作用色谱。蛋白质鉴定通常采用N端测序、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱或串联质谱（de Oliveira, Porto, Coelho, & Biotechnology, 2024）。

酶促水解在提高食品质量和营养价值方面具有巨大潜力。适当的水解可以增加蛋白质的溶解度，暴露隐藏的疏水基团，增强表面疏水性，并降低分子量，从而提高蛋白质的乳化能力并促进其在油-水界面的吸附（Zang, Yue, Wang, Shao, & Yu, 2019）。Zhang等人（2025）报告称，适度的水解促进了大豆蛋白分离物中更紧密的凝胶网络的形成，提高了其凝胶性能和风味结合能力。Herrera-Lavados等人（2025）进一步证明，脉冲电场处理（50 Hz, 15 kV/cm）增强了风味蛋白酶的活性，使得鲑鱼蛋白水解后产生了更多3-5 kDa的肽，并产生了具有抗氧化和ACE抑制活性的生物活性肽。水解引起的功能变化强烈依赖于水解程度（Lam & Nickerson, 2013）。在发酵系统中，对蛋白酶的研究主要集中在它们的水解机制及其对风味发展的潜在贡献上。Yao等人（2025）发现，Virgibacillus蛋白酶主要通过氢键和疏水相互作用水解虾肌纤维蛋白，产生了48种挥发性化合物，其中包括14种关键风味物质。类似地，Li等人（2025）观察到酵母外源蛋白酶降解了肌纤维蛋白，促进了代谢产物的形成并改善了感官质量。天冬氨酸、N-甲基天冬氨酸、Glu-Glu和γ-Glu-Cys被鉴定为水解产物中的主要风味贡献化合物。尽管取得了这些进展，大多数研究仍集中在蛋白质-酶相互作用上，而关于蛋白酶如何影响发酵产品整体质量和风味发展的研究仍然有限。

由于细菌蛋白酶具有高效的催化效率、高活性和广泛的可用性，它们被广泛应用于工业领域，其中芽孢杆菌（Bacillus）蛋白酶被研究得最为广泛。在发酵肉制品中，本土微生物也是蛋白酶的重要来源。其中，葡萄球菌属（Staphylococcus）产生的蛋白酶和脂肪酶对风味发展有重要贡献，尤其是Staphylococcus xylosus和Staphylococcus carnosus是最常用的发酵剂（Fan, Badar, et al., 2025）。Yang等人（2024）报告称，腐败葡萄球菌MY_A10具有完整的蛋白质降解、氨基酸、丙酮酸、丁醇和异亮氨酸代谢途径，在酸性发酵过程中表现出广泛的代谢活性。与Staphylococcus cohnii相比，它更有利于肽类和FAA的形成。

在我们的初步研究中，我们从哈尔滨干香肠中分离出了具有强蛋白酶产生能力的腐败葡萄球菌菌株，并纯化了它们的胞外蛋白酶。本研究探讨了不同水平葡萄球菌蛋白酶对哈尔滨干香肠质量和风味特性的影响。通过非靶向代谢组学和气相色谱-质谱（GC–MS）技术分析了挥发性和非挥发性代谢物，全面评估了蛋白质水解和微生物代谢对风味发展的影响。总体而言，本研究旨在评估腐败葡萄球菌作为肉制品新型发酵剂的潜力，为可能产生不一致质量的传统单菌株发酵剂提供替代方案。

部分摘要

发酵剂的制备

从传统的哈尔滨干香肠中分离出腐败葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus），并通过16S rDNA测序进行鉴定。将该菌株以1%（v/v）的浓度接种到MSA培养基中，在35°C下培养18小时，经过两代培养后，将培养物在4°C下以9000×g离心10分钟，收集细胞沉淀物并重新悬浮在无菌水中，再次离心以获得纯净的细胞。通过计算相应的比例来确定葡萄球菌的添加量。

物理分析

如表1所示，添加腐败葡萄球菌及其蛋白酶显著增强了干香肠的成熟过程。香肠的初始pH值为6.10，在发酵结束时，SS、P0.4、P0.8、P1.2和P1.6组的pH值分别降至5.64、5.57、5.47、5.38和5.45（P < 0.05）。将蛋白酶添加量从1.2 g/kg增加到1.6 g/kg显著提高了pH值，这可能是由于产生了氮化合物。

结论

本研究阐明了腐败葡萄球菌蛋白酶在哈尔滨干香肠中的发酵潜力，特别是其在蛋白质水解和风味发展中的作用。在发酵过程中，该蛋白酶有效降解了肌球蛋白重链、磷酸化酶和甘油醛脱氢酶，促进了风味肽和FAA等关键非挥发性代谢物的积累。同时，挥发性化合物中酸类、酮类和酯类的相对比例增加。

作者贡献声明

范宇航：撰写初稿、数据整理、可视化。 孙方达：数据整理。 陈倩：实验研究、数据分析。 刘倩：软件操作、资源准备。 刘浩天：资源准备、方法设计。 孔宝华：撰写修订、监督、资金争取、概念构思。

伦理声明

本研究的感官评估遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。作者确保了在整个试验过程中保护参与者的权利和隐私。参与完全自愿，没有任何强迫或健康风险。所有评估者均签署了同意书，数据仅在获得他们知情同意的情况下公开。

未引用参考文献

Wang et al., 2022

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：32372373）的资助。