CADD工程设计的肽类蛋白复合物（peptide protacs）能够在体内高效靶向PCSK9，从而有效治疗高胆固醇血症

《Metabolism》：CADD-engineered peptide protacs efficiently target PCSK9 for hypercholesterolemia in vivo

本研究基于计算机辅助药物设计（CADD）开发新型肽类靶向蛋白降解剂Cadd4，可有效降解细胞内PCSK9并上调LDLR表达，显著降低高脂饮食小鼠总胆固醇（25%）和LDL-C（29%），且呈现肝特异性蓄积和低毒性。与临床前药物AZD0780相比，Cadd4降脂效果更优且作用时间更长，为高胆固醇血症治疗提供创新策略。

　　

郭伟明|卢静芬|何瑶辉|查金辉|张清平|陈玉玲|谭东|唐志汉|杨静|于志健|刘淼

深圳大学附属南山医院医学研究中心，中国深圳，518000

摘要

背景

前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/凯辛酶9型（PCSK9）会促进低密度脂蛋白受体（LDLR）的降解，导致血浆中的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平升高，从而增加高胆固醇血症的风险。目前的治疗方法，如单克隆抗体和基因编辑工具，面临诸多挑战，包括高昂的成本、安全问题以及难以靶向细胞内的PCSK9。

方法

我们利用计算机辅助药物设计（CADD）技术开发了一种新型的基于肽的降解剂Cadd4，该降解剂能够特异性地靶向PCSK9。通过分子对接筛选出高亲和力的肽序列，并通过LX-2细胞的体外实验以及高脂饮食（HFD）诱导的高胆固醇血症小鼠的体内实验对其进行了验证。此外，还进行了生物分布和毒性评估，以评估其组织特异性和安全性。同时，也在人类肝脏组织中进行了实验，以评估其临床疗效。

结果

Cadd4在细胞内具有高效的摄取能力，并显著降低了PCSK9的水平，从而上调了LDLR的表达。在喂食高脂饮食的小鼠中，肝细胞中的PCSK9减少了38%，总胆固醇下降了25%，LDL-C下降了29%。生物分布分析显示Cadd4主要在肝脏中积累，且未出现全身性毒性的迹象。在人类肝脏组织中，Cadd4有效降解了PCSK9并恢复了LDLR的表达。与临床阶段的PCSK9抑制剂AZD0780相比，Cadd4表现出更强的降脂效果和更长的作用持续时间。

结论

Cadd4是一种有前景的基于CADD设计的治疗策略，通过靶向细胞内的PCSK9来实现胆固醇的调节。这种方法克服了现有疗法的关键局限性，凸显了靶向蛋白质降解在心血管疾病治疗中的潜力。

引言

近年来，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/凯辛酶9型（PCSK9）已成为治疗高胆固醇血症的关键靶点[1]。PCSK9通过与低密度脂蛋白受体（LDLR）结合并加速其降解，减少了细胞表面的LDLR数量，从而削弱了肝细胞清除低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的能力[2]。这种机制导致血浆中的LDL-C水平升高，大大增加了动脉粥样硬化和心血管疾病（CVD）的风险[3,4]。因此，开发针对PCSK9的有效疗法成为治疗高胆固醇血症的重点[3,4]。 目前针对PCSK9的治疗策略包括单克隆抗体（mAbs）、三环肽抑制剂以及siRNA和CRISPR等基因编辑技术[5,6,7]，其中单克隆抗体在临床上最为成熟且应用广泛。Evolocumab和Alirocumab等药物已显示出显著的降脂效果和降低心血管风险的作用[7,8]。然而，这些疗法存在一些局限性：生产和优化过程技术要求高且成本昂贵，限制了其可扩展性和普及性[9,10]；此外，它们通过中和细胞外的PCSK9并阻止其与LDLR的相互作用来发挥疗效[11]，但这种方法无法清除细胞内的PCSK9，可能影响长期疗效。基因编辑技术（如siRNA和CRISPR）虽然可以在基因层面长期抑制PCSK9，但在临床转化过程中面临诸多挑战，如递送效率低、组织毒性（尤其是肝脏）以及脱靶基因修饰的风险[12,13]。这些因素共同表明，亟需创新、高效且经济可行的治疗方法来克服现有PCSK9靶向疗法的局限性。 靶向蛋白质降解（TPD）技术作为一种新型疗法，通过主动诱导病理蛋白的降解来发挥作用[15]。与传统功能抑制剂不同，TPD能够克服传统疗法在持续抑制和耐药性方面的局限性，并为靶向先前“不可成药”的蛋白质提供了新的途径[16,17,18,19]。在各种TPD方法中，蛋白酶体靶向嵌合体（PROTACs）是一类独特的分子工具。PROTACs通过招募E3泛素连接酶，将目标蛋白（POI）标记为蛋白酶体降解的靶标，从而实现高效且选择性的清除。大多数已开发的PROTACs基于小分子，但针对PCSK9设计小分子PROTACs仍面临挑战。由于小分子的物理化学特性，难以实现对大型、结构复杂蛋白质（如PCSK9）的高亲和力结合，导致降解效率不高[20,21]。此外，小分子PROTAC的设计需要在生物活性、靶标选择性和药代动力学之间取得平衡，加之合成过程复杂和开发成本高，限制了其在PCSK9治疗中的应用[20,21]。 与小分子PROTACs相比，基于肽的PROTACs具有显著优势：首先，肽通常具有较低的免疫原性，有助于降低临床应用中的免疫相关不良反应风险[22,23]；其次，与细胞穿透肽（CPPs）结合可显著提高膜通透性，实现治疗载荷的有效细胞内递送[17,18]；此外，肽合成技术（尤其是固相肽合成SPPS）成熟且可扩展，能够以合理成本实现高纯度、可定制的生产[25,26]；最后，肽具有优异的结构可调性，通过合理序列设计、构象控制和化学修饰（如环化或PEG化），可实现与PCSK9等靶标的高亲和力结合[26]。尽管如此，这些优势也伴随着技术挑战，如生物活性肽的设计和筛选需要强大的技术支持，以确保其功能效力、体内稳定性和诱导泛素-蛋白酶体系统介导的降解效率。近年来，计算机辅助药物设计（CADD）的快速发展为肽基PROTACs的研发提供了重要支持，利用分子对接、分子动力学模拟和结构建模算法等技术，可以快速准确地预测肽-蛋白结合模式，显著提高药物发现的效率和成功率[27,28]。值得注意的是，肽-靶标相互作用通常涉及复杂的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），CADD在预测这类相互作用方面具有优势。 在之前的研究中，我们成功开发了一系列针对多种蛋白质的基于肽的PROTACs，具有高效的降解效果[27]。在此基础上，本研究利用CADD技术开发了一种新型的针对PCSK9的肽基降解剂，旨在克服现有疗法的局限性。通过CADD，我们精确设计了具有高亲和力的肽配体，并通过模拟筛选优化了其结构，提高了体外和体内的降解性能。与传统方法相比，CADD显著提高了筛选效率并降低了开发成本，使得大规模应用成为可能。实验验证表明，这种肽基降解剂能有效降低PCSK9水平、恢复LDLR表达并增强LDL-C的清除，显示出强大的治疗潜力。这种基于肽的靶向蛋白质降解策略为高胆固醇血症的治疗提供了新的、精确的方法，并为未来针对其他疾病相关蛋白质的肽基PROTACs开发奠定了基础。 PCSK9在高胆固醇血症的病理生理过程中起着核心作用，现有疗法的局限性（如细胞内难以到达和制造成本高）凸显了创新靶向策略的必要性。通过结合CADD和基于肽的TPD技术，本研究提出了一种高效、安全且经济可行的治疗方案，不仅扩展了高胆固醇血症的治疗可能性，还为TPD平台的临床转化和广泛应用提供了理论和实践基础。

肽降解剂的设计与膜穿透能力

利用CADD技术，我们开发了针对PCSK9的肽配体。其中得分最高的四种候选肽被合成为肽降解剂（Cadd1–4），这些分子包含细胞穿透肽（CPP序列）、PCSK9识别序列、E3连接酶结合序列和柔性连接子，从而实现了高效的膜穿透（见图1a）。使用罗丹明标记的肽降解剂在LX-2细胞中评估了其细胞内定位情况。

讨论

本研究利用CADD技术开发了一种基于肽的PCSK9降解剂Cadd4，并系统地验证了其在体外和体内的强大降解效果和良好的安全性。目前针对PCSK9的疗法（如单克隆抗体和基因编辑技术）虽然具有降脂效果，但仍存在靶标覆盖不完全和递送相关的问题[29,30,31]。

结论

本研究成功利用CADD技术设计并构建了一种新型肽降解剂Cadd4，验证了其靶向和降解PCSK9的能力以及良好的肝脏靶向特性。Cadd4通过加速PCSK9的降解，有效上调了LDLR的表达并改善了胆固醇代谢。一系列体外和体内实验证明了Cadd4在细胞摄取、靶标选择性和安全性方面的优异表现。

PCSK9靶向肽降解剂的计算设计与合成

为了开发针对PCSK9的肽降解剂，我们采用了结构导向的计算策略，并结合化学合成和实验验证。该流程基于我们之前建立的CADD平台[27]。基于Zhang等人的研究结果[49]，我们设计了一系列针对PCSK9的高亲和力肽序列。