《Molecular and Cellular Neuroscience》：The extracellular domain of mGluR6 regulates targeting to the conventional secretion pathway
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本研究针对代谢型谷氨酸受体mGluR6在视网膜ON型双极细胞中突触定位的调控机制这一关键科学问题，通过系统构建mGluR6配体结合域（LBD）系列缺失突变体，首次揭示LBD上叶结构域通过调控内质网腔内分选决定蛋白采用常规分泌途径或非常规Golgi旁路途径的核心作用，为理解GPCR类蛋白的靶向运输机制提供了新范式。
在视网膜精密的光信号传导网络中，ON型双极细胞（BCs）扮演着承上启下的关键角色。当光线刺激减弱，光感受器（如视杆细胞）释放的谷氨酸减少，此时，位于ON型双极细胞树突末梢的代谢型谷氨酸受体第6亚型（mGluR6）便会解除对TRPM1阳离子通道的抑制，导致细胞去极化，从而将“光开启”的信号传递至下游神经元。mGluR6的功能失常与先天性静止性夜盲症（CSNB）密切相关，患者表现为在暗光环境下视力严重下降。因此，深入理解mGluR6如何正确无误地抵达其突触工作岗位，是视觉神经科学领域的一个重要课题。
像其他C类G蛋白偶联受体（GPCRs）一样，mGluR6拥有一个巨大的胞外结构域（ECD），其中包含一个蝴蝶状的配体结合域（LBD）。此前的研究表明，mGluR6在视网膜和异源细胞（如HEK293T细胞）中均经历常规的分泌运输，并在高尔基体（Golgi）中获得复杂的N-连接糖基化修饰。这种成熟的糖基化修饰对于mGluR6与突触前粘附分子ELFN1的相互作用至关重要，而该相互作用是mGluR6在突触正确锚定所必需的。然而，调控mGluR6分泌运输的具体分子机制，尤其是其胞外结构域在此过程中扮演的角色，尚不清晰。一些导致CSNB的mGluR6点突变，虽然不影响其到达细胞膜，却会使其“抄近路”绕过Golgi，仅携带未成熟的核心糖基化形式出现在膜上，这提示mGluR6的LBD可能蕴含着决定其运输路径的关键信息。
为了破解这一谜题，来自加拿大达尔豪斯大学（Dalhousie University）生理与生物物理系的研究团队在《Molecular and Cellular Neuroscience》上发表了他们的最新研究成果。他们聚焦于mGluR6的LBD，特别是其上半部分（上叶），开展了一系列精巧的遗传学、细胞生物学和生物化学实验。
研究人员主要运用了分子克隆构建系列缺失突变体、细胞转染与培养、免疫荧光显微镜技术（包括表面与总蛋白标记、内化实验）、蛋白质印迹（Western blot）分析、糖苷酶（Endo H和PNGase F）处理、细胞表面生物素化标记与 pull-down 技术以及基于钙离子动员的G蛋白激活功能测定等关键技术方法。这些方法相结合，能够从蛋白质定位、翻译后修饰、膜运输动态和受体功能等多个层面，全面评估LBD结构改变对mGluR6命运的影响。
3.1. LBD的大段缺失增强mGluR6的表面表达
研究人员首先验证了之前观察到的现象：在LBD起始段删除较大片段（小鼠mGluR6的Δ24–137和Δ24–189，对应人源mGluR6的同源缺失）会显著提高其在HEK细胞表面的表达水平（约12至20倍），而总蛋白量不变。他们通过使用识别不同表位的抗体（mAb 1438和抗Flag标签抗体）以及在不同物种（小鼠和人）的mGluR6上进行验证，排除了实验假象，确认了这一表型的真实性。
3.2. 高表面表达表型并非由线性滞留信号解释
为了探究大段缺失导致表面表达激增的原因，研究者假设被删除的区域可能包含一个内质网（ER）滞留信号。然而，当他们用一系列相互重叠的小片段缺失（如Δ39–68, Δ93–124等）来覆盖大段缺失区域时，发现这些小缺失突变体的表面表达水平与野生型（WT）没有显著差异。这表明表型的出现并非由于某个特定短肽序列（线性信号）的缺失，而更可能是由于大段缺失导致LBD三维结构的改变所致。
3.3. LBD的大段缺失不破坏组成型内化
表面蛋白的稳态水平由正向运输（从ER到膜）和逆向运输（内化）共同决定。为了检验Δ突变体表面蛋白增多是否源于内化减少，研究人员利用SNAP标签标记技术进行了活细胞内化实验。结果显示，无论是WT还是大段缺失突变体（Δ30–195），其膜上的受体在4小时内都发生了显著的内化，形成明显的胞内 puncta（点状结构），且SNAP信号与膜标志抗体信号的皮尔逊相关性均显著下降。这表明大段缺失并未损害受体的组成型内化能力，表面蛋白的积累更可能归因于正向运输通量的增加。
3.4. LBD的大段缺失使得mGluR6能够通过Golgi旁路抵达质膜
接下来，研究团队通过糖基化状态分析来追踪mGluR6的运输路径。WT mGluR6在细胞裂解液中呈现Endo H敏感（核心糖基化，Band B）和Endo H抵抗（复杂糖基化，Band C）两种二聚体形式，表明其部分通过了Golgi。表面生物素化实验进一步证实，到达细胞膜的WT mGluR6几乎全是复杂糖基化形式（Band C）。令人惊讶的是，两个大段缺失突变体（Δ24–137和Δ24–189）在细胞裂解液中仍能检测到一定比例的复杂糖基化蛋白，但在细胞表面，核心糖基化（Band B）和复杂糖基化（Band C）的蛋白以大致相等的比例共存。这说明大段缺失突变体并未完全阻断Golgi运输，而是“放开”了限制，使得一部分蛋白可以绕过Golgi（仅核心糖基化）直接到达膜上，另一部分则仍能走常规途径（获得复杂糖基化）。这种双路径运输可能共同导致了表面蛋白总量的增加。
3.5. LBD的小段缺失将mGluR6限制于Golgi旁路运输
与上述结果形成鲜明对比的是，所有六个小片段缺失突变体在糖基化分析中均只显示Endo H敏感的条带，完全没有检测到复杂糖基化形式。表面生物素化实验也证实，这些突变体到达细胞膜的完全是核心糖基化的蛋白。然而，它们的表面表达水平却与WT相当。这表明，小片段缺失虽然彻底阻断了常规的Golgi运输途径，迫使mGluR6完全依赖非常规的Golgi旁路途径到达细胞膜，但该旁路途径本身在HEK细胞中足以支持一定水平的膜整合。
3.6. 所有LBD缺失均废除谷氨酸诱导的G蛋白激活
作为功能验证，研究人员通过钙动员实验检测了所有突变体激活G蛋白的能力。正如预期，由于LBD是谷氨酸的结合部位，所有缺失突变体（无论大小）均完全丧失了对谷氨酸的反应性，与空载体对照组无异。而用ATP刺激内源性P2Y受体所引发的钙反应在各组间相似，证明了实验体系的有效性。这确认了这些突变体是研究运输机制的有力工具，而其功能丧失也侧面说明了LBD结构完整性对受体功能的重要性。
该研究通过系统性的结构域缺失分析，揭示了mGluR6胞外LBD，特别是其上叶区域，在调控其分泌运输途径选择中的核心作用。研究结论可归纳为以下几点：
- 1.
关键区域定位：mGluR6 LBD的上叶存在一个对Golgi分选至关重要的结构性决定簇，而非一个简单的线性肽段信号。该区域的微小扰动（点突变或小段缺失）足以完全破坏常规运输途径，迫使蛋白采用非常规的Golgi旁路途径。
- 2.
表型差异的机制：大段缺失可能通过移除更多导致结构紊乱或干扰二聚体形成的区域，部分“挽救”了Golgi运输能力，导致蛋白可以同时利用常规和非常规途径，从而表现出表面表达量的显著增加和膜上两种糖基化形式的共存。
- 3.
调控位点：由于LBD位于ER腔内，研究结果强烈提示，存在一个ER腔内的相互作用（很可能是LBD介导的同源二聚化界面）负责将mGluR6分选进入前往Golgi的运输载体。该相互作用的破坏是导致Golgi旁路的主要原因。
- 4.
生理意义：在视网膜双极细胞中，通过常规途径获得的复杂糖基化对于mGluR6与ELFN1的稳定结合及其正确的突触定位至关重要。因此，LBD结构异常导致的Golgi分选缺陷，可能是某些CSNB病例中mGluR6功能失常的潜在分子机制。
这项研究不仅深化了我们对mGluR6这一重要视觉受体生物发生过程的理解，更重要的是，它为探索C类GPCRs乃至其他膜蛋白的非常规分泌运输机制提供了一个新的视角和模型。研究提示，蛋白质在ER腔内的构象和相互作用是决定其后续运输命运的关键检查点，这为未来干预相关蛋白质运输异常所致的疾病提供了潜在的理论基础。
