《Process Biochemistry》：An enzymatic approach for producing chitin from snow crab and American lobster seashells
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壳聚糖酶法提取工艺优化及副产物蛋白质回收研究。采用酸活性蛋白酶对雪蟹和龙虾壳进行同步脱蛋白和脱矿处理，发现胃蛋白酶最优，在2.5小时内实现蟹壳94.5%脱矿、74.0%脱蛋白，龙虾壳90.8%脱矿、81.1%脱蛋白。副产物可溶蛋白经氨基酸分析和质谱鉴定，证实适用于动物饲料及生物活性肽生产。
保罗琳·波蒂埃（Pauline Potier）|加布里埃拉·沃莱特·马松（Gabriela Vollet Marson）|阿里安·特伦布莱（Ariane Tremblay）|阿兰·多延（Alain Doyen）|露西·博利厄（Lucie Beaulieu）
加拿大魁北克省拉瓦尔大学（Université Laval）保罗-康托瓦（Paul-Comtois）馆食品科学系，功能食品与营养研究所（Institut sur la nutrition et les aliments fonctionnels, INAF），农业街2425号（rue de l’Agriculture），G1V 0A6
摘要
贝类加工厂会产生大量富含高价值生物分子的副产品，如蛋白质、矿物质和几丁质。目前，几丁质的提取主要通过使用强酸和强碱的化学水解方法进行，这种方法对环境有较大影响。为了解决这些问题，研究人员开发了一种可持续的酶法提取技术，用于从雪蟹和美洲龙虾壳中提取几丁质。测试了多种酸性蛋白酶，以确定最有效的酶，以实现壳类的同时脱蛋白和脱矿作用。结果显示，胃蛋白酶（pepsin）的效率最高，脱矿率超过95%，脱蛋白率达到78%。进一步优化了工艺，以降低酶浓度和水解时间。对于蟹壳和龙虾壳，最佳参数分别为每克蛋白质使用3130单位和2070单位的胃蛋白酶，处理时间为2.5小时。在这种条件下，蟹壳和龙虾壳的脱蛋白率分别为74.0%和81.1%，脱矿率分别为94.5%和90.8%。此外，还回收并分析了酶解产生的可溶性蛋白质，证明了它们在动物饲料和生物活性肽生产中的潜在应用价值。
引言
2022年，加拿大渔业捕捞量为712,701吨，总价值达48亿加元。贝类是加拿大渔业的主要捕捞产品，几乎全部来自大西洋海域。美洲龙虾和雪蟹是最具盈利能力的出口贝类[1]。在将甲壳类动物加工为食用产品过程中，会产生副产品，包括壳、腿、钳、肝胰腺和生理液体[2]。海洋废弃物富含营养物质，经过适当处理后具有很高的再利用潜力。例如，海洋外骨骼主要由多糖（主要是几丁质，占15%-40%）、蛋白质（20%-40%）和碳酸钙（20%-50%）组成，还含有少量色素、脂质和其他金属盐[3]。几丁质是一种由N-乙酰-D-葡糖胺单元通过β-(1-4)糖苷键连接而成的生物聚合物，具有生物相容性、可生物降解性和无毒性。尽管由于其在水和常见有机溶剂中的反应性较低和溶解度有限，几丁质的应用受到限制，但其衍生物（如壳聚糖和几丁寡糖）表现出多种生物活性，如抗菌、抗病毒、抗肿瘤和抗氧化特性[4],[5]。自2000年代以来，多项资助项目研究了几丁质的回收及其转化为壳聚糖和几丁寡糖的可行性，探讨了其效率限制、环境影响及更可持续的生物技术工艺的发展[6]。传统的几丁质提取方法使用强酸（通常在室温下）和强碱（约100°C），这种方法会产生大量化学废液，对环境和能源消耗影响较大[7],[8],[9],[10]。此外，这种工艺会破坏壳中的宝贵蛋白质，从而限制了其进一步利用[11]。因此，人们正在研究其他提取几丁质的技术，如微生物发酵[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18]，或使用原始或纯化的酶[19],[20],[21],[22],[23],[24],[25],[26],[27],[28],[29],[30]。酶法去除贝壳中的蛋白质可减少强碱的使用，使工艺更加环保。这些方法通常包括顺序的脱矿和脱蛋白步骤，但使用酸性蛋白酶可以实现壳类的同时脱蛋白和脱矿[31],[32]。例如，已有研究发表了一种使用胃蛋白酶在pH 2的磷酸溶液中提取虾壳中几丁质的优化工艺[32]。类似的工艺也在酸性条件（pH 3.5和4.0）下使用11种商业酶对虾表皮进行了测试，结果发现酸性稳定蛋白酶（ASP）在pH 4.0时脱蛋白效率超过95%[33]。鉴于不同贝壳材料的结构和成分差异，研究更环保的几丁质提取方法对于蟹壳和龙虾壳尤为重要[34],[35]。据我们所知，目前尚无关于一步酶法提取蟹壳和龙虾壳中几丁质的数据。酶法不仅有助于从甲壳类副产品中回收残留蛋白质并保持其天然状态，还能避免在最终产品中引入残留溶剂或有毒化学物质，这与传统的溶剂提取方法不同[19],[36]。这些蛋白质可用作动物饲料[19],[20],[30],[33],[37],[38],[39]，微生物生长的营养补充剂[40]，以及生物活性肽的来源[41],[42]。关于通过酶法水解甲壳类贝壳获得的残留蛋白质的研究主要集中在氨基酸含量上，而非蛋白质鉴定[20],[33],[38],[39],[41],[42],[43]。尽管通过传统蛋白质纯化方法或基因组学鉴定出了一些表皮蛋白质，但对于蟹壳和龙虾壳中其他分子的性质仍缺乏了解[44],[45],[46],[47],[48],[49]。因此，本研究旨在开发一种环保的酶法提取蟹壳和龙虾壳中几丁质的方法，并能回收和鉴定残留蛋白质。具体而言，优化了一种使用蛋白酶水解蟹壳和龙虾壳的酶法工艺，随后提取并分析了残留蛋白质的总氨基酸含量和分子大小分布，并通过质谱技术进行了蛋白质组学分析。
材料
2019年和2021年捕捞季节，Merinov公司（加拿大魁北克省加斯佩）提供了两批雪蟹（Chionoecetes opilio）和美洲龙虾（Homarus americanus）的壳。原始甲壳类贝壳在德国哈梅伦（Hameln）的Stephan切割混合机中干燥并研磨至3毫米大小（3mm），然后储存在4°C条件下直至加工和分析。
测试了几种酶以去除蟹壳和龙虾壳中的蛋白质。所用蛋白酶Aspergillus niger产生的Prolyve? Pac来自Soufflet Biotechnologies公司
原材料的化学特性
使用2019年的蟹壳和龙虾壳批次来选择最有效的酶，2021年的批次用于优化几丁质的提取过程。不同批次之间的差异见表2。贝壳的组成（干基）因捕捞季节而异。虽然同一物种的几丁质含量没有变化，但2019年的蟹壳蛋白质含量略有增加；龙虾壳的蛋白质含量则有所上升结论
本研究证实了酶法提取作为化学水解替代方法的潜力，更加可持续地从贝壳中分离几丁质。使用酸性蛋白酶可实现蛋白质和矿物质的单步去除，脱蛋白率可达66%-81%，脱矿率超过91%。在测试的酶中，胃蛋白酶的脱蛋白效果最佳，蟹壳的脱蛋白率达到74%，龙虾壳达到81%
资助
本项工作得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC, ON, Canada）[资助编号CRDPJ-538212-2018]和魁北克工业生物工艺研究与创新联盟（CRIBIQ, QC, Canada）、Les Crabiers du Nord Inc.（Portneuf-sur-Mer, QC, Canada）、La Renaissance des Iles Inc.（L'étang-du-Nord, QC, Canada）、Poisson Salé Gaspésien Ltée（Grande-Rivière, QC, Canada）、Probiotech Inc.（Saint-Hyacinthe, QC, Canada）以及E. Gagnon & Fils Ltée的支持作者贡献声明
加布里埃拉·沃莱特·马松（Gabriela Vollet Marson）：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据分析、数据管理。保罗琳·波蒂埃（Pauline Potier）：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构建。露西·博利厄（Lucie Beaulieu）：审稿与编辑、项目监督、资金筹集、概念构建。阿兰·多延（Alain Doyen）：审稿与编辑、项目监督、资金筹集。阿里安·特伦布莱（Ariane Tremblay）：撰写初稿、结果验证利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。致谢
作者感谢所有参与捕捞的渔业公司（E. Gagnon & Fils Ltée、La Renaissance des ?les、Lelièvre Lelièvre et Lemoignan Ltée、les Crabiers du Nord Inc.、Poisson Salé Gaspésien Ltée和Unipêche M.D.M Ltée）提供的蟹和龙虾，以及Merinov公司提供的蟹壳和龙虾壳。同时感谢拉瓦尔大学食品科学系的Diane Gagnon和Fran?oise Nadeau在技术方面的支持。
