《Sensors and Actuators B: Chemical》：Precise and highly sensitive detection of single nucleotide variations with a
PfAgo and individualized probe combined fluorescent assay
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本研究建立了PfAgo与个性化探针结合的荧光检测法（PIPFA），用于高灵敏度、单碱基分辨率的SNV检测。该方法结合等温RT-RPA扩增和PfAgo特异性切割，通过荧光探针可视化结果，灵敏度达10?-101 copies/μL，适用于POCT。研究揭示PfAgo的碱基识别偏好性，即5’端磷酸化的gDNA第二条碱基可被精准识别。
裴王|林艳|吴慧玲|赵晨杰|郭波|洪健|夏文龙|唐一鑫|高松
盐城师范学院海洋与生物工程学院，中国盐城224007
摘要
单核苷酸变异（SNVs）在精准医学领域具有重要的临床价值。SNV检测是一种高分辨率的核酸检测方法，但在开发SNV检测方法时，如何在准确性和便捷性之间取得平衡始终是一个挑战。本研究建立了一种结合了PfAgo和个性化探针的荧光检测技术（PIPFA），用于精确且高灵敏度地检测SNVs。PIPFA结合了可编程核酸酶PfAgo和等温逆转录聚合酶扩增（RPA）技术，构建了一种使用常见实验室工具即可实现的用户友好型检测流程，适用于即时检测（POCT）应用。本研究以SARS-CoV-2 S基因中的L452R/Q/M SNVs作为模型目标。PIPFA能够实现单核苷酸级别的分辨率，可以区分单个位点或相邻位点的多种变异，灵敏度达到10^0–10^1拷贝/μL。该检测流程操作简便，仅需两种恒定温度即可完成反应，无需热循环，并且结果可在蓝光下直接观察。重要的是，本研究揭示了PfAgo在单核苷酸识别方面的偏好规则：即PfAgo能够清晰区分gDNA 5’-磷酸化末端第二个碱基。PIPFA技术对于应对未来流行病挑战具有重要意义，同时有助于提高资源有限地区的SNV检测能力。
引言
单核苷酸变异（SNVs）是指在特定基因组位点存在两种或更多不同核苷酸碱基的遗传变异。这些变异广泛存在于包括人类、病毒和细菌在内的多种生物体中[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。研究表明，SNVs在精准医学领域具有重要的临床价值[6]、[7]、[8]、[9]。例如，许多肿瘤的药物耐药性与SNVs有关，因为它们的突变谱直接影响个性化治疗的效果和治疗结果[10]、[11]、[12]。在过去的COVID-19大流行期间，SARS-CoV-2基因组关键位点的SNVs与多种变异体的出现密切相关，这促使预防和治疗策略进行了调整[13]、[14]、[15]。
SNV检测的最直接方法是核酸测序[16]、[17]、[18]。除此之外，还报道了其他更便捷的检测方法，包括基于聚合酶链反应（PCR）的方法、DNA微阵列、高分辨率熔解分析（HRMA）、变性高效液相色谱（dHPLC）、限制性片段长度多态性（RFLP）和单链构象多态性（SSCP）分析[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。这些方法缩短了检测时间，简化了流程并降低了成本，但仍需要专门的设备和人员[3]、[5]。最近，可编程核酸酶被应用于SNV检测。著名的例子包括使用CRISPR系统中的Cas核酸酶的SHERLOCK、DETECTR和HOLMES方法，以及使用Argonaute核酸酶的A-star、NAVIGATER和PAND方法[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。这些可编程核酸酶的使用使得操作更加用户友好，并且可以使用常见实验室工具进行，从而提高了资源有限地区的SNV检测可行性。然而，SNV检测是一种高分辨率的核酸检测方法，需要能够区分单核苷酸差异。在开发SNV检测方法时，如何在准确性和便捷性之间取得平衡始终是一个挑战[3]、[5]。
来自Pyrococcus furiosus的PfAgo是一种可编程核酸酶，已被用于检测多种生物分子目标，包括SNVs[30]、[33]、[34]、[35]。PfAgo在5’-磷酸化的单链（ss）引导DNA（gDNA）的引导下特异性识别并切割DNA目标。不仅目标序列的识别具有特异性，而且切割位点也预先确定为从互补gDNA 5’-磷酸化末端开始的第10到第11个碱基之间。PfAgo的这种精确性使其比具有非特异性切割活性的Cas核酸酶更适合设计高分辨率的核酸检测方法。事实上，PfAgo至少能够实现双核苷酸级别的分辨率[36]。
然而，也有研究表明，PfAgo在处理单核苷酸差异时并不总是高效。在开发基于PfAgo的SNV检测方法时，通常需要进行大量的gDNA筛选，甚至需要在gDNA序列中引入额外的碱基错配，这非常繁琐[30]、[32]、[36]、[37]、[38]、[39]。因此，揭示PfAgo在单核苷酸识别方面偏好的研究是非常有价值的。
本研究建立了一种结合PfAgo和个性化探针的荧光检测技术（PIPFA），用于精确且高灵敏度地检测SNVs。以SARS-CoV-2 S基因中的L452R/Q/M SNVs作为模型目标，这些SNVs是监测SARS-CoV-2变异和流行趋势的关键基因型指标[40]。该流程分为两步：首先使用等温逆转录聚合酶扩增（RT-RPA）扩增包含L452位点的SARS-CoV-2基因组片段[41]，然后利用特定的gDNA和相应的个性化荧光探针区分L452R、L452Q和L452M变异。PIPFA的荧光结果显示，即使L452R变异的目标浓度低至10^0拷贝/μL、L452Q变异的目标浓度为10^1拷贝/μL、L452M变异的目标浓度为10^0拷贝/μL，也能实现无交叉信号的情况。这种极高的灵敏度使得该流程简单易行，无需特殊设备或培训，表明PIPFA是一种优秀的SNV检测系统。重要的是，本研究揭示了PfAgo在单核苷酸识别方面的偏好规则：即PfAgo能够清晰区分gDNA 5’-磷酸化末端第二个碱基。
部分内容
寡核苷酸
标准质粒模板来自含有SARS-CoV-2野生型（WT）基因组638个核苷酸片段的质粒（GenBank编号NC_045512.2，22793-23430 nt，L452R/Q/M SNV位点位于22916和22917位置）。通过DNA合成（General Biology Co. Ltd., 安徽，中国），将638个核苷酸片段插入pET-28b(+)载体中的T7启动子和T7终止子之间，构建了WT质粒。L452R/Q/M三种SNV质粒均由此WT质粒衍生而来
PIPFA原理
结合PfAgo和个性化探针的荧光检测技术（PIPFA）包括使用RPA（或对于RNA目标使用RT-RPA）对目标片段进行等温扩增，以及利用PfAgo在gDNA引导下识别SNV，并通过个性化探针产生荧光信号（图1A）。个性化探针是一种发夹形单链DNA，其环区序列对应于SNV目标中被切割的片段，荧光基团和淬灭基团分别标记在探针的两端
讨论
SNV检测是一种高分辨率的核酸检测方法，在资源有限的地区进行即时检测（POCT）具有挑战性[5]。可编程核酸酶和等温扩增技术的应用使核酸检测流程更加用户友好，对特殊设备的依赖性降低[27]、[28]、[29]，从而有望提高SNV检测的可行性。在本研究中，我们将可编程核酸酶PfAgo与...
结论
本研究建立了高灵敏度SNV检测的PIPFA系统。该系统结合了可编程核酸酶PfAgo和等温RPA技术，构建了一种使用常见实验室工具即可实现的用户友好型检测流程，适用于POCT应用。重要的是，本研究揭示了PfAgo在单核苷酸识别方面的偏好规则：即PfAgo能够清晰区分gDNA 5’-磷酸化末端第二个碱基。
作者贡献声明
裴王：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、数据可视化、验证、项目管理、方法设计、实验设计、资金获取、数据分析、概念构建。林艳：撰写 – 原稿、方法设计、实验设计。吴慧玲：方法设计、实验设计、数据管理。洪健：方法设计、概念构建。夏文龙：方法设计、概念构建。赵晨杰：方法设计、实验设计、数据管理。郭波：方法设计
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了江苏省基础研究计划（编号BK20241088）、江苏省高等教育机构自然科学基金（编号24KJB180026）、盐城市重点研发计划（编号YCBE202439）以及江苏省海洋生物资源与环境重点实验室开放基金（编号SH20221208和SH20231212）的支持。
裴王目前是中国盐城师范学院海洋与生物工程学院的助理教授。她刚刚在中国南京师范大学食品科学与制药工程学院完成了博士后研究。她在中国华中科技大学生命科学技术学院获得了博士学位。她目前的研究主要集中在新型分子检测技术上
