《Sensors and Actuators B: Chemical》：Surface-Engineered Paper-Based Microfluidic Platform for Fully Automated RPA Detection of Swine Viral Diseases
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非洲猪瘟和伪狂犬病毒快速检测：基于表面改性的全自动微流控纸片分析系统，通过氧等离子体处理和聚乙烯吡咯烷酮涂层增强毛细管流动，将试剂传输时间缩短67%，实现10拷贝/μL的检测灵敏度，满足ASSURED标准要求。
Jihong Sun|Weiqin Xu|Yining Wang|Lizhe Chen|Yaoqi Wang|Tong Li|Haibo Ma|Meng He|Kai Hoettges|Mark Leach|Shuailong Zhang|Zhenxin Hu|Junhui Zhu|Pengfei Song
西安交通大学-利物浦大学先进技术学院，中国苏州仁爱路111号，215000
摘要
快速准确地检测非洲猪瘟（ASF）和伪狂犬病（PR）等猪病毒性疾病对于防止大规模疫情爆发和减少畜牧业的经济损失至关重要。在核酸扩增方法中，重组酶聚合酶扩增（RPA）特别适合用于猪病毒的即时检测，因为它是在恒温条件下进行的，并且可以在大约20分钟内得出结果。基于微流控技术的纸质分析设备（μPADs）为开发即时检测RPA设备提供了一个有前景的平台，这些设备成本低、使用方便且样品消耗量小。然而，现有的基于纸张的RPA系统仍然面临实际挑战，包括自动化程度不足以及由于在纸质基质中加入了粘性添加剂（如PEG）而导致试剂传输速度慢的问题。为了解决这些问题，我们采用了一种表面修饰方法来加速流体传输，并开发了一种完全自动化的μPAD，用于ASFV和PRV的筛查。这种方法提高了毛细驱动的流速，将试剂转移时间从约82秒缩短到约27秒（减少了67%）。此外，流速的提高并非在制造后立即显现，而是在第3天到第11天之间逐渐稳定下来，确保了在预期使用条件下的可靠运行。这种“样品输入，结果输出”的系统无需外部设备，能够在11.5分钟和14.5分钟内分别检测出每微升10个ASFV和PRV拷贝，显示出高灵敏度和快速的结果，适用于资源有限环境中的实际现场病毒诊断。
引言
猪病毒性疾病对养猪业构成了重大威胁，导致了巨大的经济损失并破坏了长期的可持续性[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。其中，伪狂犬病病毒（PRV）和非洲猪瘟（ASF）尤其令人担忧，因为它们具有高度传染性[2]、[3]，并且会引起严重的死亡率和群体层面的混乱[4]、[6]。PRV的特点是猪仔出现神经系统症状，而母猪则会出现呼吸系统和生殖系统障碍[3]、[7]。相比之下，ASF是一种高度传染性的出血性疾病，表现为发热、厌食和广泛的组织损伤[5]、[8]。除了直接导致的死亡外，PRV和ASFV还可能引发毁灭性的疫情，并由于贸易限制和扑杀措施给未受影响的农场带来巨大的间接损失[9]。尽管许多国家已经广泛采用了血清学和分子诊断方法，但这些技术通常耗时较长，需要昂贵的仪器，并且需要技术熟练的人员[9]、[10]、[11]。世界卫生组织（WHO）在2003年提出了ASSURED标准，以指导即时检测（POCT）平台的发展[12]、[13]。该框架概述了POCT平台的理想特性，强调其价格实惠、灵敏度高、特异性强、用户友好、速度快、无需设备以及易于使用[12]、[14]、[15]、[16]。这些特性对于养猪业的兽医诊断尤为重要，因为农场环境往往缺乏实验室基础设施、冷链资源和受过培训的操作人员[13]、[17]、[18]。
核酸扩增检测（NAAT）仍然是病原体检测的临床金标准，因为它能够直接针对病原体特有的基因组，具有高灵敏度和特异性[19]、[20]。传统的NAAT技术包括聚合酶链反应（PCR）和定量PCR（qPCR），这些技术需要复杂的热循环、较长的反应时间和精确的温度控制[21]、[22]，这限制了它们在现场应用的适用性。相比之下，RPA在恒定的低温（37-42°C）下运行，在30分钟内完成扩增，并且不需要大型热仪器[23]。此外，RPA避免了与环介导等温扩增（LAMP）相关的复杂引物设计要求，并且减少了非特异性扩增的可能性，从而降低了假阳性率[24]。这些特性使得RPA特别适合在即时检测（POC）和资源有限的环境中进行快速、可靠的病原体检测[25]、[26]。RPA利用三种酶：重组酶蛋白、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶，在等温条件下实现特定目标DNA的扩增[26]、[27]。然而，要使RPA真正成为一种即时检测技术，仅靠等温化学是不够的。它需要一个能够自主处理样品引入、试剂传输、混合、孵育和检测的平台，而无需外部泵或复杂的机械系统。基于纸张的微流控设备（μPADs）为这一挑战提供了一个有前景的解决方案[28]。通过利用固有的毛细驱动流速，μPADs能够通过预定义的通道实现试剂的被动传输，从而消除了对外部泵的需求，并支持紧凑、无需设备的架构。μPADs还在低成本制造、生物相容性、可丢弃性和易用性方面具有优势，使其特别适合分散式诊断和大规模现场部署[25]、[27]、[29]、[30]。因此，μPADs代表了将RPA从实验室协议转化为便携式、现场即用型POCT平台的实际途径。
尽管有这些优势，但仍存在一个主要问题：高粘度RPA试剂（尤其是含有聚乙二醇（PEG）的试剂）的传输速度慢[31]，PEG是酶稳定性和扩增效率所必需的添加剂[32]。纸张的多孔纤维素基质在这种粘度下显著限制了流速，导致试剂传输时间延长和工作流程整合受阻。为了解决这个问题，各种基于纸张的RPA平台采用了不同的策略。Rohrman和Richards-Kortum以及Chen等人开发了可折叠的基于纸张的RPA设备，其中储存在不同隔间的试剂通过手动折叠接触，从而实现后续的混合和反应启动[33]、[34]。这些基于折叠的方法引入了额外的手动操作，增加了操作错误的风险，并可能导致试剂分布不均，从而可能引起反应不完全和检测可靠性降低。Chen等人构建了一个用于诊断尿路感染的离心芯片[35]，另一组Chen等人提出了一种用于检测铜绿假单胞菌的自动化离心微流控系统[36]，其中利用旋转力主动混合RPA试剂与样本。尽管这些系统改善了流速控制，但它们通常需要外部电动离心机和集成机械部件（如电机轴），这增加了设备的体积和复杂性，限制了便携性，并将流体路径限制在离心力产生的径向方向。Cordray及其同事开发了一种基于滑块的纸质设备，其中可移动的滑块实现了顺序试剂混合和扩增[37]。然而，它严重依赖于手动操作，可能会降低重复性并阻碍完全自动化。这些限制突显了需要一种解决方案，能够在无需手动干预或外部驱动的情况下，在纸质基质中高效传输和混合高粘度试剂，同时支持自动化的、完全集成的核酸扩增工作流程。我们的工作重点就是结合使用流速增强表面修饰技术和低成本机械系统来解决这一需求。
本研究介绍了一种基于纸张的微流控芯片与RPA结合的POCT平台，用于同时检测ASFV和PRV。该设备（如图1所示）包含一个旋转微阀系统，用于自动化顺序试剂混合、流体输送和温度调节，实现“样品输入，结果输出”的功能，无需手动干预。为了克服含有PEG的试剂导致的试剂传输缓慢的问题，我们采用了一种表面工程策略，结合了氧等离子体处理和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）涂层，通过减少传输时间约67%来增强毛细驱动流速，同时保持了分析的完整性。值得注意的是，这种改进并非在制造后立即显现，而是在第3天到第11天的老化窗口期内达到稳定性能，为后续检测提供了一致的操作条件。在这种稳定状态下，实验结果显示ASFV和PRV的检测限均为每微升10个拷贝，并成功捕获了两种病原体的特征扩增曲线。与商业检测系统的比较分析显示了出色的稳定性，证实了我们平台的临床可靠性和商业可行性。总体而言，该设备满足了ASSURED标准所规定的基本特性，特别适合在资源有限的环境中使用。
平台开发
我们的平台如图2a所示，主要由两部分组成：一个一次性基于纸张的检测设备和集成在支撑结构中的读取器。平台的爆炸视图如图2b所示。基于纸张的检测设备上的芯片图案是使用Autodesk计算机辅助设计（AutoCAD 2024）设计的。具体来说，它包括两个扇形部分（图2c），每个部分的半径为45毫米，分别称为旋转芯片和固定芯片。
经氧等离子体处理的纸张的形态
研究了经过氧等离子体和PVP处理的纸张芯片上的流道形态。图3a显示了在不同氧等离子体暴露时间下，用恒定浓度PVP溶液（13%）处理的纸张的SEM图像。在等离子体处理之前，纤维束表面光滑（图3a（i））。值得注意的是，在这种浓度下，PVP溶液在纳米尺度上没有明显的涂层现象，表明
结论
在这项研究中，我们开发了一个完全集成的旋转式基于纸张的微流控平台，该平台配备了微阀系统，用于快速自动检测ASFV和PRV。为了解决基于纸张的RPA检测中高粘度PEG导致的试剂传输效率低的问题，我们提出了一种表面修饰策略，结合了氧等离子体处理和PVP沉积。优化等离子体暴露时间和PVP浓度显著提高了
CRediT作者贡献声明
Yaoqi Wang：可视化、验证。Tong Li：验证、正式分析。Haibo Ma：研究。Jihong Sun：写作——审稿与编辑、写作——初稿、可视化、验证、资源获取、研究、正式分析、数据管理、概念化。Zhenxin Hu：资源获取、项目管理、概念化。Weiqin Xu：可视化、验证、数据管理。Junhui Zhu：监督、资源获取、项目管理。Yining Wang：研究、正式分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢中国自然科学基金（62573363）、江苏省高等教育自然科学基金（24KJB460030）和西安交通大学RDF项目（RDF-21-02-076）的支持。这项工作还得到了西安交通大学人工智能研究中心、江苏省工程研究中心（数据科学与认知计算）以及SIP人工智能创新平台（YZCXPT2022103）的部分支持。
Jihong Sun于2020年在中国苏州的上海科技大学和英国利物浦大学获得了生物医学工程学位，并于2022年在英国诺丁汉大学获得了生物医学工程硕士学位。他目前是西安交通大学的一名博士生，他的研究方向是用于即时诊断的完全自动化的基于纸张的微流控平台。
