《Translational Oncology》：Unraveling the anti-cancer potential of procyanidin B2 from grape seeds in gastric cancer through a multi-omics approach with emphasis on ROS and ferroptosis
编辑推荐：
本研究针对胃癌治疗中化疗毒性大、易耐药等难题，聚焦天然黄酮类化合物原花青素B2（PB2）的抗癌潜力。通过多组学整合分析结合体内外实验验证，发现PB2可通过抑制AKT/mTOR信号通路、激活AMPK/p21轴诱导G0/G1期周期阻滞；同时通过促进铁离子释放、增强Fenton反应、破坏NRF2抗氧化系统，诱发内质网应激和自噬依赖性铁死亡，从而显著抑制胃癌细胞增殖、迁移并促进细胞死亡。该研究为PB2作为低毒性天然抗胃癌候选药物提供了扎实的理论依据。
胃癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，尽管近年来发病率有所下降，但由于人口老龄化，患者绝对数量仍在增加。在中国，2020年约有47.8万新发病例，给公共卫生系统带来沉重负担。化疗是胃癌主要治疗手段，但存在毒性和耐药性限制。许多源自膳食植物的物质因其低毒性和广泛可得性，作为潜在抗癌剂被广泛研究。黄酮类多酚因其广泛的生物活性而备受关注，如槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和染料木素。原花青素是黄酮类的一个亚类，是通过C4-C8或C6-C8键连接黄烷-3-醇形成的寡聚体。原花青素在自然界中含量丰富，占葡萄籽水提取物的70%以上。自然界中最常见的原花青素二聚体是B型原花青素，主要存在于葡萄籽、可可豆和山楂等来源中。与单体儿茶素相比，聚合原花青素表现出更高的生物活性。原花青素B2（PB2）是多种原花青素中生物活性最强的聚合物，因其抗氧化、抗炎、抗肿瘤和抗病毒特性而被广泛报道。然而，氧化应激在PB2抗胃癌治疗活性中的作用尚未探索。
本研究旨在通过多组学方法，结合体外和体内实验，全面评估PB2对胃癌的抗癌潜力，并重点阐明其与活性氧（ROS）和铁死亡相关的分子机制。研究发现PB2能有效抑制胃癌细胞AGS和HGC-27的增殖、迁移和集落形成能力，并诱导细胞凋亡。机制上，PB2处理导致细胞内ROS水平升高，氧化应激加剧，并伴随抗氧化酶（如GSH-PX、CAT）活性降低以及谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）比率下降。转录组和代谢组学分析显示，PB2处理后差异表达基因和代谢物显著富集于氧化应激、内质网应激、铁死亡、嘌呤和嘧啶代谢等通路。进一步实验证实，PB2通过抑制AKT和ERK磷酸化，下调其下游mTOR和c-MYC表达，从而抑制核苷酸从头合成关键酶（如CAD、UMPS、GART、PFAS、ADSL、ATIC、IMPDH、DHODH、PPAT、PRPS）的表达，阻碍肿瘤细胞增殖。同时，PB2激活AMPK，上调p21表达，诱导G0/G1期细胞周期阻滞。此外，PB2触发的氧化应激导致内质网应激，表现为PERK/EIF2α/ATF4/CHOP通路激活。更重要的是，PB2增强自噬流，促进核受体共激活因子4（NCOA4）介导的铁蛋白自噬（ferritinophagy），释放游离铁离子，进而通过Fenton反应加剧脂质过氧化，最终诱发铁死亡，其特征为脂质过氧化物（如MDA、4-HNE）积累，以及铁死亡关键蛋白（如GPX4、SLC7A11）下调，ACSL4上调。体内荷瘤小鼠实验证实，PB2处理能显著抑制肿瘤生长，降低肿瘤增殖标志物Ki-67表达，增加凋亡标志物cleaved-caspase-3表达，并伴随肿瘤组织内ROS水平升高、铁离子积累、GSH耗竭以及自噬和铁死亡相关蛋白的变化。研究还发现PB2能降低促炎细胞因子（如IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1）水平，并减少巨噬细胞招募。药代动力学研究表明PB2口服生物利用度约为9.48%。安全性评价显示PB2在实验剂量下对心、肝、肺、肾等主要器官未见明显毒性。
为开展研究，研究人员运用了多种关键技术方法。细胞功能实验包括CCK-8法检测细胞活力、克隆形成实验、划痕实验检测迁移、流式细胞术分析细胞周期和凋亡、JC-10检测线粒体膜电位、Trans-well实验评估巨噬细胞招募。分子机制研究采用了蛋白质印迹（Western Blot）、免疫荧光、免疫组化、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测相关蛋白和细胞因子表达。氧化应激相关指标如ROS、O2?、H2O2、GSH/GSSG、8-OH-DG以及抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-PX）活性通过相应试剂盒测定。利用透射电子显微镜观察细胞超微结构变化。多组学分析包括对PB2处理的胃癌细胞进行转录组测序（RNA-seq）和代谢组学（LC-MS/MS）分析，并通过联合分析筛选关键通路。体内研究使用了BALB/c裸鼠HGC-27细胞异种移植瘤模型，评估PB2的抑瘤效果和安全性，并进行组织病理学（H&E染色）和免疫组化分析。体外Fe(II)检测和羟基自由基生成实验用于探讨PB2与铁离子的相互作用。此外，还进行了药代动力学研究和大鼠血清PB2含量检测。
Procyanidin B2 suppresses the proliferation and migration of AGS and HGC-27 cells
研究通过CCK-8实验发现PB2以时间和浓度依赖性方式显著抑制AGS和HGC-27胃癌细胞的活力，IC50值表明AGS细胞对PB2更敏感。PB2对正常胃黏膜上皮细胞GES-1仅在较高浓度下有轻微抑制，显示其安全性。集落形成实验表明PB2显著降低胃癌细胞的集落形成能力。PCNA蛋白表达随PB2浓度增加而下降。形态学观察显示PB2处理后细胞贴壁密度降低、体积变小、贴壁不规则。肿瘤标志物（CA125、CEA、CA199、CA724、MG7-Ag）水平显著降低。划痕实验显示PB2抑制细胞迁移，并伴随E-cadherin表达上调，N-cadherin、vimentin和MMP-2表达下调。
Procyanidin B2 arrests cell cycle and triggers apoptosis in vitro
流式细胞术显示PB2处理使胃癌细胞阻滞在G0/G1期，G2/M期细胞比例减少。Western Blot检测发现PB2下调CDK4、cyclin D1、mTOR蛋白表达，上调p21蛋白表达，并增加p-AMPK/AMPK比率，提示PB2可能通过促进AMPK磷酸化，进而下调mTOR、上调p21来抑制胃癌细胞发展。Annexin V/PI双染和cleaved-caspase-3免疫荧光证实PB2诱导细胞凋亡。JC-10染色显示PB2降低线粒体膜电位。Western Blot显示PB2处理增加BAX表达，降低BCL-2表达，并降低AKT磷酸化水平，表明PB2通过抑制AKT激活，调控BCL-2和BAX，增加线粒体外膜通透性，激活caspase-3，最终诱导胃癌细胞凋亡。
Procyanidin B2 attenuates immune cytokine production and inhibits macrophage recruitment in vitro
ELISA和Western Blot结果显示PB2降低胃癌细胞中促炎因子IL-6、IL-10、COX-2、TNF-α、IL-1β、MCP-1的表达，升高IL-4表达。Trans-well实验表明PB2处理的胃癌细胞对RAW 264.7巨噬细胞的招募能力显著降低。Western Blot显示PB2下调IκBα和NF-κB p65的磷酸化水平以及ERK表达，提示PB2可能通过MAPK-ERK和AKT/mTOR通路抑制IκBα/NF-κB p65轴激活，从而缓解胃癌细胞的炎症状态。
Gastric cancer cell death induced by procyanidin B2 is partially dependent on ROS elevation involved in iron ions
PB2处理导致胃癌细胞内ROS、H2O2、O2?水平升高，GSH/GSSG比率降低，DNA氧化损伤标志物8-OH-DG上调。抗氧化酶GSH-PX和CAT活性降低。NRF2及其下游抗氧化蛋白NQO1、HO-1表达下降。使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理可减轻PB2引起的氧化应激和细胞死亡。铁螯合剂去铁胺（DFO）预处理也能部分缓解氧化应激和细胞死亡，而铜螯合剂新铜试剂（neocuproine）无此效果。体外实验表明PB2促进Fe(III)向Fe(II)的转化，并增强铁驱动的Fenton反应中的自由基生成。量子化学计算支持PB2促进Fe(III)还原为Fe(II)在热力学上有利。这些结果提示PB2诱导的胃癌细胞死亡至少部分依赖于涉及铁离子的氧化应激。
Transcriptional profiling of AGS and HGC-27 cells under procyanidin B2 treatment
转录组分析显示PB2处理后AGS和HGC-27细胞差异表达基因显著。GO和KEGG富集分析表明差异基因富集于“氧化应激反应”、“内质网应激反应”、“p53信号通路”、“铁死亡”、“化学致癌-活性氧”、“嘌呤代谢”、“嘧啶代谢”、“内质网中的蛋白质加工”等通路。GSEA显示PB2处理后基因集在“氧化应激诱导的细胞死亡的正调控”等方面正富集，在“PI3K-AKT-mTOR信号”、“细胞周期”、“氧化磷酸化”、“DNA复制”、“嘌呤代谢”等方面负富集。关键基因如PCNA、p21、CAT、SOD、NRF2、mTOR、ERK、ATM、ATR、CHOP、ATF4、ATG7、p62、ACSL4、NCOA4等的转录水平发生改变。qRT-PCR验证了RNA-seq结果。
Metabolomic profiling of AGS and HGC-27 cells treated with procyanidin B2
代谢组学在AGS和HGC-27细胞中鉴定出779种代谢物。PCA和OPLS-DA显示PB2处理组与对照组代谢谱明显分离。差异代谢物分析发现PB2处理后氧化型谷胱甘肽等代谢物水平变化。KEGG通路富集分析显示差异代谢物显著富集于“嘧啶代谢”、“嘌呤代谢”、“谷胱甘肽代谢”等通路。
Joint analysis of metabolome and transcriptome
转录组和代谢组联合分析显示差异代谢物与差异基因之间存在显著相关性。联合KEGG富集分析再次强调了“嘌呤代谢”、“嘧啶代谢”、“谷胱甘肽代谢”和“铁死亡”通路的重要性。网络图揭示了凋亡、自噬、细胞应激、铁死亡和核苷酸代谢之间通过PI3K-AKT和MAPK信号通路的潜在联系。
Procyanidin B2 suppresses the progression of gastric tumors xenografted in mice in vivo
体内实验表明，PB2处理能显著抑制HGC-27细胞裸鼠移植瘤的生长，减小肿瘤体积和重量。H&E染色显示PB2组肿瘤细胞形态不规则，出现染色质浓缩和广泛坏死区域。IHC显示PB2降低Ki-67阳性率，增加cleaved-caspase-3表达。肿瘤组织内促炎细胞因子水平降低，CD45+CD3+CD8+T细胞比例增加。主要器官H&E染色和血清生化指标（ALT、AST、BUN、 creatinine）显示PB2在实验剂量下无明显毒性。药代动力学显示PB2口服生物利用度较低（约9.48%），消除半衰期较短（约2.2小时）。
Procyanidin B2 inhibits the de novo synthesis of nucleotide substrates
IHC和Western Blot证实PB2处理降低移植瘤组织中嘌呤和嘧啶核苷酸从头合成关键酶（如DHODH、PPAT、PRPS、CAD、UMPS、GART、PFAS、ADSL、ATIC、IMPDH）的蛋白表达。免疫荧光显示c-MYC核定位减少。表明PB2通过调控ERK/c-MYC轴抑制核苷酸合成。
Procyanidin B2 disrupts the NRF2 and glutathione antioxidant system in xenograft tumors and promotes oxidative stress
体内实验证实PB2处理增加肿瘤组织ROS和O2?水平，降低GSH/GSSG比率和GSH-PX活性，降低CAT和SOD活性，下调NRF2、HO-1、NQO1蛋白表达。线粒体膜电位降低。表明PB2在体内破坏NRF2依赖性抗氧化防御，升高瘤内ROS水平。
Procyanidin B2 promotes endoplasmic reticulum stress accompanied by mitochondrial morphological changes associated with ferroptosis
电镜显示PB2处理导致内质网肿胀扩张和线粒体形态异常（体积减小、嵴丢失、膜破裂）。Western Blot显示PB2增加PERK和EIF2α磷酸化，以及ATF4和CHOP表达，表明发生内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）。
Procyanidin B2 treatment resulted in autophagy-involved ferroptosis
普鲁士蓝染色显示PB2增加肿瘤组织铁离子积累。Western Blot显示PB2增加脂质过氧化标志物MDA和4-HNE，上调ACSL4，下调SLC7A11和GPX4。电镜显示自噬小体增加。Western Blot显示LC3II/LC3I比率增加，NCOA4上调，FTH1下调。使用自噬抑制剂3-MA或CQ，以及铁死亡抑制剂Fer-1或铁螯合剂DFO预处理，可部分逆转PB2引起的脂质过氧化、相关蛋白表达改变和细胞活力下降。表明PB2通过增强自噬流，促进铁蛋白自噬释放游离铁，诱发铁死亡。
The ferroptosis elicited by procyanidin B2 may incorporate p53 participation, although it operates independently of p53
在携带野生型p53的AGS细胞中，PB2处理可上调p53表达；而在携带p53突变（P153Afs*）的HGC-27细胞中则检测不到p53表达。但在HGC-27移植瘤中仍观察到p21（p53下游靶点）上调。表明PB2抑制胃癌进展可能存在p53依赖和非p53依赖两种机制。
本研究通过多组学整合分析并结合系统的体内外实验，深入揭示了天然化合物原花青素B2（PB2）抗胃癌的多重作用机制。PB2不仅能通过抑制AKT/mTOR和ERK信号通路，下调c-MYC表达，进而全局性抑制核苷酸从头合成关键酶，阻碍肿瘤细胞增殖；还能激活AMPK/p21轴诱导细胞周期阻滞。更重要的是，PB2通过破坏NRF2抗氧化系统，升高细胞内活性氧（ROS）水平，诱发氧化应激。此氧化应激状态一方面导致内质网应激和凋亡，另一方面通过增强自噬流，促进NCOA4介导的铁蛋白自噬，释放游离铁离子，加剧Fenton反应，导致脂质过氧化积累，最终引发自噬依赖性的铁死亡。此外，PB2还能调节肿瘤免疫微环境。体内实验证实了PB2的有效抑瘤作用和良好安全性。该研究不仅为PB2作为低毒性天然抗胃癌药物的开发提供了坚实的理论依据和实验支持，也揭示了靶向氧化应激-自噬-铁死亡轴在胃癌治疗中的新策略，具有重要的科学意义和转化潜力。研究成果发表在《Translational Oncology》期刊上。
