《Vaccine》：A combination of new prefusion mRNA and protein vaccines enhances neutralizing antibodies and protection against respiratory syncytial virus
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本研究开发了含DS-Cav1前融合蛋白突变的新pre-F mRNA疫苗，结合LNP递送系统。实验表明，联合pre-F mRNA-LNP与低剂量pre-F蛋白疫苗可显著提升中和抗体水平（较单一疫苗高）及平衡的CD8 T细胞应答，有效降低小鼠肺部病毒载量并减轻病理损伤，为RSV疫苗设计提供了新策略。
Surya Sekhar Pal | Ki-Hye Kim | Noopur Bhatnagar | Phillip Grovenstein | Jannatul Ruhan Raha | Chau Thuy Tien Le | Rong Liu | Bo Ryoung Park | Young-Man Kwon | Chong Hyun Shin | Bao-Zhong Wang | Sang-Moo Kang
美国乔治亚州立大学生物医学科学研究所炎症、免疫与感染中心，亚特兰大，GA 30302
摘要
呼吸道合胞病毒（RSV）在儿童和老年人中导致高住院率和死亡率。基于融合前构象稳定的RSV F蛋白疫苗已被批准用于老年人和孕妇的接种。然而，仍存在对有效RSV疫苗的需求，特别是针对老年人和幼儿的疫苗，以避免疫苗引起的疾病加重。我们开发了一种新的融合前mRNA，其中包含原型（DS-Cav1 pre-F）稳定序列以及额外的融合结构域突变。这种新的pre-F mRNA疫苗封装在脂质纳米颗粒（LNP）中，在小鼠体内能够有效诱导中和抗体和Th1型效应T细胞反应。值得注意的是，pre-F mRNA-LNP与pre-F蛋白的组合比单独使用任一疫苗都能显著提高针对RSV A和B株的中和抗体滴度。与原型pre-F蛋白相比，pre-F mRNA及其与pre-F蛋白的组合通过清除肺部的病毒载量、防止肺组织病理变化和炎症提供了更好的保护作用。此外，这种组合疫苗还能在感染后调节平衡的效应CD8 T细胞反应。本研究支持这样的观点：结合使用pre-F mRNA和pre-F蛋白疫苗可以提供比单独使用mRNA或蛋白疫苗更有效的体液免疫和细胞免疫。
引言
呼吸道合胞病毒（RSV）是幼儿急性下呼吸道感染的主要原因，全球每年约有3400万例病例；在美国，65岁及以上的成年人中，RSV每年导致约6000至10,000例死亡[1]。20世纪60年代进行的一项使用明胶佐剂的福尔马林灭活RSV疫苗试验显示，接种该疫苗的幼儿在自然感染RSV后可能会出现呼吸道疾病加重（ERD）[2]。野生型（WT）RSV融合（F）蛋白疫苗在成人中具有免疫原性，但未能提供高效的RSV相关疾病防护[3]。先前的研究强调了针对融合前构象的中和抗体的重要性[4][5][6]。
含有佐剂的pre-fusogenic F纳米颗粒疫苗能够诱导出与Palivizumab竞争性的中和抗体[7,8]，对RSV相关住院治疗的防护效果为39–48%，但未能满足FDA的批准标准[3,9]。据报道，一种包含pre-F构象稳定突变（DS-Cav1）的融合前（pre
F）外域蛋白能够在可溶性三聚体形式中稳定暴露Φ表位，并比post-F蛋白疫苗诱导更强的RSV中和抗体[10]。自pre-F稳定F蛋白被发现以来，主要的RSV疫苗候选物均基于原型pre-F（DS-Cav1）开发。辉瑞公司的双价RSV A和B pre-F蛋白疫苗（60–240 μg）已被批准用于老年人和孕妇的接种[11,12]。GSK公司的RSV PreF3疫苗（120 μg）结合AS01E佐剂（QS-21皂苷+MPL脂质体递送系统）也被批准用于老年人接种[13,14]。含有p27缺失和融合肽缺失的DS-Cav1衍生物的pre-F mRNA疫苗也具有免疫原性，并获得了老年人接种许可[15][16][17]。虽然已批准的RSV pre-F蛋白和mRNA疫苗能为高风险老年人提供保护，但关于这些疫苗在幼儿中的安全性和使用风险[18]仍需进一步研究。
我们之前的研究报道了一种改进的pre-F稳定构象（F1d-dcmTM），该构象在融合结构域中添加了额外突变，并将融合前F蛋白包裹在类病毒颗粒（VLP）上，其诱导RSV中和抗体的效果优于原型DS-Cav1-TM在VLP上的效果[19]。蛋白亚单位疫苗诱导的T细胞反应较弱[12,14,20]，并且在RSV初次感染的儿童中可能存在ERD的安全风险[21][22][23][24]。先前的研究显示，高剂量（10 μg mRNA）的RSV pre-F mRNA疫苗在小鼠中具有免疫原性和有效性[25][26][27]。已知高剂量的脂质纳米颗粒（LNP）在体内具有炎症作用，相当于在小鼠体内封装10–30 μg的mRNA[28]，并且据报道在联合使用时可增强流感血凝素蛋白（10 μg）的免疫原性[29]。
在本研究中，我们生成了一种新的pre-F mRNA构象，其中除了DS-Cav1外，还在切割位点和融合结构域中添加了突变，这种构象在诱导RSV特异性中和抗体方面比原型DS-Cav1在VLP上的效果更好[19]。这种新的pre-F mRNA疫苗具有免疫原性，能够诱导pre-F特异性IgG、中和活性和T细胞反应。此外，我们测试了低剂量pre-F mRNA-LNP（1 μg）与pre-F蛋白（0.3 μg）联合使用的假设，发现这种组合在小鼠模型中显著增强了免疫原性和对RSV的防护效果。
人类上皮细胞系（HEp-2, CCL-23）、人类胚胎肾细胞（HEK）293 T细胞（CRL-3216）、Vero细胞（CRL-1586）以及人类RSV B株18537（RSV B, VR-1580）均来自美国典型培养物收藏中心（ATCC，马里兰州罗克维尔）。HEp-2和HEK 293 T细胞在含有10%胎牛血清（FBS，Gibco）、2 mM谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（Gibco）的完全DMEM培养基（Dulbecco's Modification of Eagle's Medium；康宁公司，弗吉尼亚州马纳萨斯）中培养。
融合前F mRNA构象可表达带有pre-F和II位点表型的RSV F蛋白
F蛋白需要经过furin切割才能从预-F的锥形结构转变为棒棒糖形状，从而实现膜融合[36,37]。同时具有furin切割突变和部分疏水融合肽残基缺失的F突变构象能够促进融合前F蛋白的表达，使II位点的中和表位以膜锚定形式稳定暴露[8,38]。含有p27和融合肽缺失的DS-Cav1衍生物的pre-F mRNA疫苗...
我们的目标是开发一种有效的RSV疫苗候选物和新的接种策略。新设计的pre-F mRNA疫苗构象旨在模仿之前已被证明具有免疫原性的pre-F（F1d-dcmTM）VLP基蛋白疫苗[19]，能够诱导pre-F特异性IgG和RSV中和抗体反应。pre-F构象特异性mAb（D25, 5C4）对?位点的结合特性，以及针对II位点的Palivizumab的结果，都支持这种新pre-F mRNA疫苗的有效性...
Surya Sekhar Pal：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化处理、验证、项目监督、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。
Ki-Hye Kim：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学设计、实验研究。
Noopur Bhatnagar：撰写 – 审稿与编辑、验证、实验研究。
Phillip Grovenstein：撰写 – 审稿与编辑、验证、实验研究。
Jannatul Ruhan Raha：撰写 – 审稿与编辑...
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
本研究部分得到了乔治亚州立大学内部资助（S.-M.K.）和NIH/NIAID资助（AI154656，S.-M.K.）。资助方未参与实验设计、数据收集、数据分析、论文发表决策或手稿准备。DS-Cav-1 pre-F蛋白和pre-F特异性5C4 mAb由Graham博士（VRC，NIAID，NIH）提供；Palivizumab由Eun-Hyung Lee博士（埃默里大学，GA）提供。
