《Vaccine: X》：Comparative technical and operational assessment of current and emerging bench-scale lipid nanoparticle platforms for production of mRNA vaccines
编辑推荐：
本研究针对mRNA疫苗生产关键技术瓶颈，系统评估了四种实验室尺度脂质纳米颗粒（LNP）混合平台。研究人员通过对比交叉流混合、撞击射流混合、环形混合和转子-定子混合技术，发现前三类微混合平台生产的mRNA-LNP在粒径（80-100 nm）、包封率（>95%）和免疫原性方面表现优异，而转子-定子混合平台因包封率低（≤50%）和粒径过大（300-350 nm）导致免疫应答显著减弱。该研究为疫苗研发者选择适宜平台提供了关键数据支撑，对促进中低收入国家mRNA疫苗技术普及具有重要意义。
随着COVID-19疫情全球蔓延，mRNA疫苗以前所未有的速度登上历史舞台，而其核心递送技术——脂质纳米颗粒（LNP）的制备工艺则成为决定疫苗效力的关键因素。尽管LNP技术已在发达国家成功应用，但在中低收入国家（LMICs）推广时却面临严峻挑战：高端混合设备价格昂贵、维护复杂、技术转移困难，这严重制约了全球疫苗公平分配。更棘手的是，目前缺乏对不同LNP制备平台的系统性比较数据，研究人员在选择适合其研发需求的平台时往往缺乏科学依据。
在此背景下，PATH研究所的Changcheng Zhu团队在《Vaccine: X》发表了一项开创性研究，对四种主流实验室尺度LNP混合平台进行了全面技术评估。研究人员选取了代表不同混合机制的设备：Micropore Technologies的AXF-mini/Pathfinder（交叉流混合）、Knauer的IJM NanoScaler（撞击射流混合）、Cytiva的NanoAssemblr Ignite（环形混合）以及Silverson的L5M-A实验室混合器（转子-定子混合）。这些平台分别采用独特的流体动力学原理：交叉流混合通过微孔膜实现两相接触，撞击射流混合依靠高速射流对撞，环形混合利用涡旋流场，而转子-定子混合则采用机械剪切力。
为确保公平比较，研究团队严格统一了实验条件：使用相同的脂质组成、氮磷比（N/P ratio）为6:1、mRNA载量，并分别测试了携带荧光素酶（luc-mRNA，1921个核苷酸）和SARS-CoV-2刺突蛋白（4000个核苷酸）两种不同长度的mRNA构建体。通过多批次重复实验（每平台至少12个批次），团队从理化特性、结构形态、体内表达效率和免疫原性四个维度进行了系统分析。
关键技术方法包括：采用动态光散射测定粒径和PDI（多分散指数），RiboGreen法定量mRNA包封率，冷冻透射电镜（cryo-TEM）观察结构形态，活体成像系统检测荧光素酶表达，以及ELISA法测定小鼠血清中SARS-CoV-2特异性IgG抗体水平。所有动物实验均采用BALB/c小鼠模型，符合伦理规范。
3.1. Luc-mRNA-LNP和SARS-CoV-2 mRNA-LNP制剂表征
结果显著显示：三种微混合平台（交叉流、撞击射流、环形混合）制备的LNP均呈现优异的一致性，粒径控制在80-100 nm范围内，多分散指数（PDI）低于0.20，mRNA包封率超过95%。而转子-定子混合平台则表现迥异：其制备的空心LNP粒径约180 nm，与mRNA后混合后粒径显著增大至300-350 nm，包封率骤降至≤50%。琼脂糖凝胶电泳进一步验证了这一结果——微混合平台样本中游离mRNA条带极微弱，而转子-定子混合样本出现明显条带，表明mRNA未被有效包封。
3.2. mRNA-LNP的冷冻电镜分析
冷冻透射电镜揭示了更细微的结构差异：交叉流混合形成的LNP呈均匀球形，mRNA主要位于颗粒核心；撞击射流与环形混合产生的LNP表面存在较多mRNA"水泡"（blebs）；而转子-定子混合样本则呈现典型的双层囊泡结构，核心多为空腔，mRNA主要附着于颗粒表面。这种形态差异暗示不同混合动力学会影响mRNA在LNP中的空间分布。
3.3. Luc-mRNA-LNP生物发光成像
体内分布研究呈现关键发现：微混合平台制备的LNP在肌肉注射8小时后，不仅能在注射部位表达荧光素酶，还能通过血液循环在肝脏富集，实现全身性蛋白表达。相反，转子-定子混合平台由于颗粒尺寸过大，其LNP被限制在注射部位局部，无法进入循环系统。这种分布差异直接影响了后续的免疫应答效果。
3.4. 免疫原性研究
最重要的免疫实验数据表明：三种微混合平台均能诱导强烈的SARS-CoV-2特异性IgG抗体反应，且组间无统计学差异（p>0.05）。而转子-定子混合平台的抗体水平显著低于其他平台（p<0.0001）。值得注意的是，尽管电镜显示三种微混合平台的LNP结构存在"水泡"差异（撞击射流和环形混合平台较多，交叉流混合平台较少），但这种形态差异并未显著影响其免疫效果，说明不同mRNA分布模式都可能实现有效递送。
讨论部分深入剖析了各平台的操作特性：交叉流混合平台采用不锈钢流路，可通过自动灭菌降低污染风险，但流体阻力较大；撞击射流混合平台需乙醇清洗，操作流程复杂但已被辉瑞疫苗生产验证；环形混合平台使用一次性卡匣，极大简化操作但增加耗材成本；转子-定子混合平台虽成本低廉且无需有机溶剂，但其固有的高剪切力易导致mRNA降解。
本研究首次对四种差异化LNP平台进行了从理化性质到体内功效的系统对比，填补了该领域的技术空白。特别值得关注的是，研究发现即使采用完全相同的配方参数，不同混合机制也会显著影响LNP的最终性能。这一结论对疫苗研发企业具有重要指导意义——在选择平台时不仅需考虑成本因素，更应关注其混合原理与目标产品特性的匹配度。
尽管研究存在一定局限（如未与已上市疫苗直接对比、未考察长期稳定性），但其建立的综合评价框架为后续研究提供了范本。随着circRNA（环状RNA）和saRNA（自扩增RNA）等新型核酸药物的兴起，这种平台比较方法可进一步扩展至更广泛的核酸递送领域。该研究通过科学数据证实了简化LNP生产技术的可行性，为促进mRNA疫苗技术在全球范围内的可及性奠定了重要基础。
