一种自组装的Pirococcus abyssi外泌体复合物，其中含有Leptospira interrogans的外膜蛋白，能够引发针对钩端螺旋体病的保护性免疫反应

《Vaccine》：A self-assembled Pirococcus abyssi exosome complex displaying outer membrane proteins of Leptospira interrogans elicits protective immunity against leptospirosis

本研究开发了一种基于Pyrococcus abyssi外泌体复合体的新型重组多价疫苗EXOLEP，表达Leptospira关键抗原Ligani、LigBrep和LipL32。实验证实该疫苗在高温及长期储存（4℃一年）下稳定性高，与Canicola菌苗联用在小鼠模型中显示80-100%的保护率，并诱导Th1/Th2平衡的免疫应答，为兽医用高效、经济、可扩展的钩端螺旋体病疫苗提供了新思路。

　　

Natasha Rodrigues de Oliveira | Mara Andrade Colares Maia | Tiffany Thurow Bunde | Ana Carolina Kurz Pedra | Jady Duarte Nogueira | Laura de Vargas Maiocchi | Amilton Clair Pinto Seixas Neto | Livia Maria Faim | Mariana Antao Cavalcanti Pizani | Paulina Consuelo Morales Arancibia | Thaís Larré Oliveira Bohn | Odir Ant?nio Dellagostin

巴西南里奥格兰德州佩洛塔斯市佩洛塔斯联邦大学生物技术中心

摘要

钩端螺旋体病是一种由钩端螺旋体（Leptospira spp.）引起的广泛传播的人畜共患病。目前正在探索新的疫苗策略，以增强保护的强度和持续时间。在这项研究中，我们开发了一种新型重组疫苗配方，利用Pyrococcus abyssi的外泌体复合物来呈现关键钩端螺旋体抗原（LigANI、LigBrep和LipL32）的免疫原性区域。构建了一个共表达载体，将Pyrococcus abyssi的外泌体蛋白与三种钩端螺旋体抗原融合，生成了EXOLEP（EXOsome + LEPtospira）多价复合物，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达了这些多肽。通过体外和体内实验验证了EXOLEP的稳定性，显示出显著的抗性，在高达100°C的温度下仍能保持稳定，并且保质期延长。在仓鼠模型中，一种混合EXOLEP配方（EXOLEP Copenhageni + 来自Canicola血清型的钩端螺旋体菌苗）对Canicola和Copenhageni血清型的钩端螺旋体提供了80–100%的保护作用（P < 0.05）。此外，这种混合配方诱导了平衡的Th1/Th2免疫反应，表现为IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β的上调，以及对所有钩端螺旋体抗原的IgG1和IgG2/3亚型的显著水平（P < 0.05）。该配方在4°C储存一年后仍保持效力。这些结果表明，EXOLEP混合配方是一种有前景、成本效益高且可扩展的兽医用钩端螺旋体疫苗候选物。

引言

钩端螺旋体病是一种重新出现的具有重大公共卫生影响的动物源性疾病，尤其影响潮湿亚热带和热带地区的低收入人群[1]。迄今为止，已在基因组水平上鉴定出74种钩端螺旋体物种，其中21种被认为是致病性的[2]。脂多糖（LPS）的结构异质性是这些细菌分类的基础，在流行病学和临床背景下起着关键作用，至少描述了260种致病血清型[3]。尽管该属内存在多样性，但L. interrogans仍然是导致人类和家畜感染的主要致病物种[4]。 全细胞灭活钩端螺旋体菌苗（bacterins）疫苗在全球范围内被广泛用于家养和牲畜动物，尽管其在人类中的使用仍然非常有限[5]。这些疫苗主要旨在引发针对配方中特定血清型LPS的体液免疫反应[6]。气候事件，如洪水和淹没，与人类和动物的钩端螺旋体病高峰和暴发有关。这在巴西等热带和亚热带国家尤为令人担忧[7]。由于早期诊断工具的有限可用性，常规疫苗接种仍然是控制地方性地区动物种群疾病的关键策略，从而减少人类暴露[8]。 除了传统的疫苗方法外，重组疫苗作为一种有前景的策略正在研究中。通过靶向保守的蛋白质抗原，这些配方可以单独使用或与传统疫苗结合使用，以扩大免疫覆盖范围并增强免疫记忆[9]。将选定的免疫原性抗原与最佳表达平台或递送系统结合，可以实现高表达水平、快速生长、降低制造成本和缩短生产时间[9,10]。多项研究表明，使用不同的重组疫苗配方具有显著的保护效果。在重组疫苗研究中，最常评估的钩端螺旋体抗原中，LigA、LigB和LipL32的免疫原性区域得到了最广泛的表征[9]。虽然LigA在不同递送平台上一贯表现出保护效力，但LigB和LipL32的表现更为多变，通常受佐剂选择和抗原呈现策略的影响[9,11]。尽管存在这种变异性，由于这些脂蛋白具有强烈的免疫原性特征和在钩端螺旋体疫苗研究中的长期相关性，它们仍被反复研究。我们的研究小组之前开发了一种表达来自LipL32和LigA的嵌合蛋白的重组BCG疫苗，该疫苗在同类仓鼠挑战中提供了保护[12]。然而，由于BCG在兽医领域可能引起干扰牛结核病诊断的交叉反应性免疫反应，其使用受到限制[9]，这凸显了需要替代平台。尽管取得了这些进展，但仍然缺乏一种能够持续诱导广泛交叉保护的重组疫苗。

伦理声明

所有动物实验均在佩洛塔斯联邦大学（UFPel）的动物设施进行，并得到了UFPel动物使用伦理委员会（CEUA）的批准（协议编号4268–2019）。CEUA获得了巴西国家动物实验控制委员会（CONCEA）的认证。在整个实验期间，动物的饲养符合CONCEA的指南。

细菌菌株和培养

大肠杆菌菌株在液体Luria-Bertani（LB）培养基中培养（180 rpm）

EXOLEP设计

LigA蛋白包含1224个氨基酸残基，形成13个Ig样结构域。前六个结构域与LigB的结构域具有高度序列一致性，而最后七个结构域是LigA特有的，被称为LigANI（非同源结构域）[20]。先前的实验数据表明，第10-13个结构域对保护作用至关重要[28]；因此，仅选择这些结构域进行进一步分析。LigB蛋白包含1890个残基，组织成12个Ig样结构域。

讨论

重组疫苗技术的进步扩大了改善钩端螺旋体病预防和控制的可能性[31]。后基因组时代通过反向疫苗学研究（Reverse Vaccinology）促进了多种疫苗候选物的鉴定[17,32]。尽管在各种疫苗方法中测试了新的抗原，但经典的表面蛋白，如LipL32和Lig蛋白，仍然是在不同平台上评估的最可靠的抗原[9]。尽管LigA仍然...

结论

在这项研究中，我们提供了初步证据，支持使用Pyrococcus abyssi外泌体作为多价抗原递送平台的可行性。使用Pyrococcus abyssi外泌体作为疫苗载体，开发出了EXOLEP，该疫苗具有高产量、溶解性和免疫原性。将Canicola菌苗纳入EXOLEP混合配方中，成功促进了针对犬类主要感染血清型的交叉保护。免疫反应的特征...

CRediT作者贡献声明

Natasha Rodrigues de Oliveira：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、验证、软件使用、方法学设计、实验实施、数据分析、概念化。 Mara Andrade Colares Maia：方法学设计、实验实施。 Tiffany Thurow Bunde：方法学设计、实验实施。 Ana Carolina Kurz Pedra：方法学设计、实验实施。 Jady Duarte Nogueira：方法学设计、实验实施。 Laura de Vargas Maiocchi：方法学设计、实验实施。 Amilton Clair Pinto Seixas Neto：方法学设计...

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本手稿的过程中，作者使用了ChatGPT来提高可读性和语言表达。使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。

资助

本工作得到了巴西国家科学技术发展委员会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq）、巴西高等教育人员培训协调局（Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES）（财务代码001）以及南里奥格兰德州研究支持基金会（Funda??o de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul, FAPERGS）的支持。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Dellagostin报告称，Ourofino Saúde Animal Ltda提供了财务支持、行政支持、药物或试剂以及写作协助。de Oliveira、Maia和Bohn拥有待授权的专利#BR1020250084961。作者声明，本研究是在与Ourofino Saúde Animal的合作下进行的...

致谢

我们感谢巴西圣保罗大学（Universidade de S?o Paulo, USP）兽医与动物科学学院（Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia）的Silvio Arruda Vasconcellos博士，他慷慨提供了致病性L. interrogans Canicola菌株LO-4。