《Vaccine》：Plaque reduction neutralization test (PRNT
50) for the detection of anti-yellow fever antibodies from clinical samples
编辑推荐：
本研究开发并验证了PRNT50检测方法用于黄热病毒中和抗体测定。该方法通过优化6孔板格式，提高灵敏度与重复性，验证显示其具有高特异性、精密度和准确性，适用于疫苗免疫评估和自然感染诊断。
帕里克希特·泰亚吉（Parikshit Tyagi）| 米兰·甘古利（Milan Ganguly）| 萨蒂亚普拉萨德·马尼（Satyaprasad Manney）| 库廷纳特·瓦德卡（Kuntinath Wadkar）| 尼莱什·英格尔（Nilesh Ingle）| 苏尼尔·加伊罗拉（Sunil Gairola）| 拉吉夫·德赫雷（Rajeev Dhere）| 朱莉娅·拉皮尼（Giulia Lapini）| 保罗·坎塔洛尼（Paolo Cantaloni）
印度血清研究所私人有限公司（Serum Institute of India Private Ltd），地址：印度马哈拉施特拉邦浦那市哈达普萨尔（Hadapsar），索利·普纳瓦拉路（Soli Poonawalla Road）212/2号，邮编411028
摘要
黄热病（Yellow Fever，YF）是一种由蚊子传播的病毒性出血性疾病，在南美洲和非洲的部分地区仍然呈地方性流行。尽管已有安全有效的疫苗可以使用超过75年，但在地方性流行和散发病例的地区，黄热病仍然是一个公共卫生问题。自然感染黄热病病毒或接种疫苗后产生的免疫反应表现为中和抗体的产生。黄病毒（flaviviruses）的血清学交叉反应性给检测黄热病特异性抗体的诊断测试带来了挑战。最特异性的斑块减少中和试验（Plaque Reduction Neutralization Test，PRNT）被认为是检测和测量中和抗体的“金标准”方法。本研究旨在开发并验证一种用于测量黄热病特异性中和抗体的内部PRNT50测试。我们通过特异性、线性、精确度、准确性和稳健性等不同参数验证了PRNT50测试。结果表明，黄热病PRNT50检测方法具有特异性、稳健性、精确性和准确性。因此，我们证明了该方法适用于评估自然感染或接种黄热病疫苗后产生的中和抗体。
引言
黄热病（YF）是一种急性蚊媒病毒性出血性疾病，在南美洲和非洲的部分地区呈地方性流行。全球每年约有20万例病例和3万例死亡病例，其中近90%的病例来自非洲[1]。重症黄热病的病死率在30%到60%之间[2,3]。黄热病病毒（YFV）属于黄病毒科（Flaviviridae）的正黄病毒属（Orthoflavivirus），与其他重要的黄病毒（如登革热病毒（DENV）、西尼罗河病毒（WNV）、日本脑炎病毒（JEV）和寨卡病毒）具有系统发育和抗原上的相似性。临床上，黄热病病毒感染可表现为从轻微的自限性发热到严重的多器官功能障碍和死亡等多种疾病[4]。
目前，尚无针对黄热病的特异性抗病毒疗法；因此，通过疫苗接种进行预防仍然是控制疾病发病率和死亡率的最有效策略。使用减毒活黄热病病毒（例如17D或17DD株）进行疫苗接种非常有效，是黄热病控制的基石。为了支持临床试验中的疫苗效力评估，量化中和抗体反应至关重要，因为这些抗体被广泛认为是保护作用的相关指标。黄热病的实验室诊断主要依赖于使用酶联免疫吸附试验（ELISA）或其他血清学方法检测血清样本中的病毒特异性免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）抗体。然而，由于黄病毒包膜蛋白高度同源，这些检测方法在黄病毒共存或先前接触过黄病毒的地区会出现显著的交叉反应[5][6][7][8]，这可能会导致假阳性或结果不明确，从而影响试验对疫苗免疫原性的可靠评估。因此，使用更特异和功能性的检测方法进行确认性测试是必要的。
在血清学检测方法中，中和试验是最特异的，被认为是评估黄病毒特异性免疫反应的金标准[9]。斑块减少中和试验（PRNT）最初是在五十多年前开发的[10]。在PRNT试验中，血清中的病毒中和抗体通过与病毒颗粒结合来抑制易感细胞的感染并防止斑块形成。PRNT可以通过不同的终点（如PRNT50或PRNT90）来估计中和抗体的反应强度[11]。在PRNT试验中，通过标准化量的感染性病毒，评估血清样本的系列稀释液对斑块形成减少50%（PRNT50）或90%（PRNT90）的能力[12][13][14]。通常使用PRNT90终点来提高检测的严格性，尽管这会降低灵敏度，而PRNT50则更适合需要高灵敏度的应用[11]。
为了在临床试验结果评估中使用，开发并验证优化的PRNT检测方法是必要的。这样的PRNT必须满足关键性能标准：特异性（特别是在黄病毒共存或先前接触的情况下）、重复性精度（在每次检测和不同检测之间）、强线性或可稀释性（在不同稀释度下的一致性）以及对参数变化（如中和孵育时间）的稳健性。
本研究旨在开发并验证一种用于临床样本中血清学检测抗黄热病病毒中和抗体的内部PRNT50检测方法。尽管已经引入了适应96孔板的微型PRNT格式以提高通量，但如果不严格控制检测条件，这些格式可能会导致重复性降低。在本研究中，选择了6孔板格式进行PRNT，因为其具有更好的分析灵敏度和更优的斑块可视化效果。6孔板的较大表面积允许使用更高的接种量，促进斑块的形成，并减少斑块重叠，从而在较小孔板格式中避免常见的斑块合并问题。
本研究旨在提供一种特定、可靠且可重复的方法，用于评估接种疫苗或自然感染后的免疫反应。
部分内容摘录
细胞系
用于病毒扩增的细胞系为来自英国健康保护局（Health Protection Agency，HPA）培养库的非洲绿猴肾细胞（Cercopithecus aethiops）。细胞在Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM；Thermo Fisher Scientific，美国）培养基中维持，培养基中添加了10%的热灭活胎牛血清（FBS；Euroclone，意大利）、1%青霉素/链霉素（Lonza，瑞士）、1% L-谷氨酰胺（Lonza，瑞士）和1% HEPES缓冲液（Lonza，瑞士）。
特异性
该检测方法对黄热病病毒具有高度特异性，因为所有添加了黄病毒的样本和黄热病阳性血清样本均符合预定义的接受标准。所有添加病毒的样本组（YF + JE、YF + Zika 和 YF + Dengue）以及黄热病阴性血清样本（YF + NS）的计算百分比标准差（%GSD）均低于50%，从而证实了检测方法的精确性，并排除了与其他黄病毒的交叉反应（表1）。
讨论
基于17D病毒株的减毒活黄热病疫苗被认为是迄今为止最成功的疫苗之一[17,18]。通过测定抗体滴度来评估自然感染和黄热病疫苗引起的免疫反应。尽管酶免疫测定（ELISA）由于其低成本、高特异性和快速出结果而最常用于抗体测定，但在黄病毒血清学研究中使用起来较为困难。
结论
本研究提供了一种特异性强、准确度高、精确度高的方法来检测黄热病的中和抗体。我们开发的YF PRNT50测试非常适合通过测量中和抗体滴度来评估临床试验中的疫苗保护性免疫反应。
CRediT作者贡献声明
帕里克希特·泰亚吉（Parikshit Tyagi）：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学、概念构思。米兰·甘古利（Milan Ganguly）：验证、方法学、概念构思。萨蒂亚普拉萨德·马尼（Satyaprasad Manney）：验证、方法学。库廷纳特·瓦德卡（Kuntinath Wadkar）：方法学、研究。尼莱什·英格尔（Nilesh Ingle）：撰写 – 原始草稿、方法学、研究。苏尼尔·加伊罗拉（Sunil Gairola）：监督、方法学、概念构思。拉吉夫·德赫雷（Rajeev Dhere）：监督、方法学、概念构思。朱莉娅·拉皮尼（Giulia Lapini）：验证、方法学、研究。保罗·坎塔洛尼（Paolo Cantaloni）：
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者使用了ChatGPT来改进语法并提高文本的可读性。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。
资金支持
本研究由印度血清研究所私人有限公司（Serum Institute of India Private Limited）的内部资金支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢世界卫生组织（WHO）日内瓦分部和英国国家生物标准与控制研究所（NIBSC）提供的黄热病疫苗株和抗血清。
