靶向乙型肝炎病毒的CRISPR/Cas9系统体内递送新策略：负载核糖核蛋白-寡核苷酸复合物的脂质纳米粒优化研究

《Virus Research》：Optimization of lipid nanoparticles loaded with ribonucleoprotein-oligonucleotide complexes for in vivo delivery of a CRISPR/Cas9 system targeting hepatitis B virus

本文聚焦慢性乙型肝炎病毒（HBV）治疗难题，研究团队通过优化负载CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物的脂质纳米粒（LNP）递送系统，显著提升其抑制HBV复制的能力。实验表明，新型LNP载体CL4F11_ζ-2联合热处理的WJ11向导RNA可有效降低血清病毒载量及肝内cccDNA水平，为实现HBV功能性治愈提供了创新性治疗策略。

　　

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球重大公共卫生问题，全球约3.3%人口受其困扰。尽管世界卫生组织提出2030年消除乙肝目标，但现有治疗手段如核苷类似物难以清除肝细胞内的共价闭合环状DNA（cccDNA）——这种顽固的病毒转录模板可长期潜伏，导致慢性感染和肝癌风险。更棘手的是，整合入宿主基因组的HBV DNA仍可表达病毒蛋白，引发持续免疫炎症反应。因此，开发能直接靶向cccDNA的创新疗法成为当务之急。

近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术为精准打击HBV带来了曙光。日本鹿儿岛大学研究团队此前筛选出高效向导RNA（WJ11），可在体外和动物模型中抑制HBV复制。然而，基于腺相关病毒（AAV）的递送系统需要极高剂量（每只动物10¹²-10¹³拷贝），临床转化困难。脂质纳米粒（LNP）作为新兴递送载体，在siRNA疗法中已展现优势，但如何优化其用于CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）的体内递送仍是挑战。

为此，研究团队在《Virus Research》发表最新成果，系统比较了三种LNP载体（CL4H6、CL4F11_ε-3和CL4F11_ζ-2）递送WJ11/Cas9复合物的效果。关键技术方法包括：利用微流控装置制备LNP，采用人源化嵌合小鼠模型（人肝细胞置换率>80%）评估体内抗病毒效果，通过qPCR定量血清HBV DNA与肝内cccDNA，并借助T7E1酶切测序验证基因编辑效率。

研究结果方面：

3.1. WJ11/Cas9负载CL4H6 LNP的体内效果

首轮试验中，虽CL4H6 LNP封装效率达82.3-85.5%，但连续14天静脉注射后，小鼠血清HBV DNA、肝内HBV DNA及cccDNA水平均未出现显著下降，提示该载体靶向肝细胞效率不足。

3.2. WJ11/Cas9负载CL4F11_ε-3 LNP的体内效果

改用分支结构脂质CL4F11_ε-3后，血清病毒载量虽呈下降趋势，但统计学差异不显著，且肝内病毒复制指标反高于对照组。值得注意的是，治疗组血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平持续上升，提示可能存在肝细胞损伤风险。

3.3. WJ11/Cas9负载CL4F11_ζ-2 LNP的体内效果

突破出现在优化后的CL4F11_ζ-2 LNP联合热处理WJ11 sgRNA（使其形成均一单体结构）。该方案使血清HBV DNA在第5、7、10天显著降低（p<0.05），肝内HBV DNA、cccDNA以及乙肝表面抗原（HBsAg）、核心相关抗原（HBcrAg）也呈现下降趋势。T7E1 assay和测序结果证实，小鼠肝组织中出现HBV基因组缺失及点突变，直接验证了CRISPR/Cas9的编辑活性。

讨论部分强调，CL4F11_ζ-2 LNP的“花状结构”更利于大分子RNP递送，而热处理sgRNA能提升封装效率。与传统AAV相比，LNP方案将临床等效剂量从10¹⁵拷贝/人降至100毫克/人，且避免了免疫原性风险。尽管当前清除效率仍需提升，但该研究为功能性治愈HBV提供了可行路径。未来需进一步优化LNP组分、给药策略，并开发更经济的动物模型以推动临床转化。