《Parasitology》：Molecular diagnostics for cutaneous leishmaniasis: progress towards fulfilling the WHO target product profile
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本文推荐介绍了一种针对皮肤利什曼病（CL）诊断的最新研究进展。为解决现有诊断工具灵敏度不足、成本高且无法进行虫种鉴定的难题，研究人员系统评述了分子诊断技术，特别是等温扩增技术（如LAMP）在实现WHO目标产品规范（TPP）中的潜力。研究表明，LAMP技术展示了高灵敏度（93%）和特异性（87%），且便携式设备成本已降至2000美元以下，为在资源有限地区实现快速、精准的CL诊断提供了可行路径，对推动2030年消除规划具有重要意义。
在热带与亚热带地区的众多贫困社区，一种名为皮肤利什曼病（Cutaneous Leishmaniasis, CL）的寄生虫病正悄然蔓延。它由利什曼原虫（Leishmania spp.）引起，通过白蛉叮咬传播，导致患者皮肤出现难以愈合的溃疡，不仅带来身体上的痛苦，还常常因瘢痕造成毁容，给患者带来沉重的社会心理负担。尽管世界卫生组织（WHO）将其列为被忽视的热带病（Neglected Tropical Diseases, NTDs）之一，并制定了《2030年路线图》，目标是到2030年使85%的病例在流行国家得到检测，但现实却十分严峻。据最新数据，仅有27%的病例被报告，估计实际年发病数可能高达百万。现有的诊断工具，如显微镜检查和血清学测试，往往存在灵敏度不足、无法区分致病虫种、或需要复杂的实验室设施和专业技术人员等局限，远未达到WHO目标产品规范（Target Product Profile, TPP）中关于灵敏度（>90%）、特异性（95-100%）、低成本（每测试1-5美元）和易用性的要求。尤其随着耐药性（特别是热带利什曼原虫Leishmania tropica）的出现，以及埃塞俄比亚等特定地区利什曼原虫遗传多样性高导致商业诊断试剂盒性能不佳，开发一种能够快速、准确、在资源有限条件下进行虫种鉴定的新型诊断工具变得尤为迫切。这篇发表在《Parasitology》上的综述性文章，系统梳理了分子诊断技术，特别是等温扩增技术在应对这些挑战中的最新进展和未来方向。
为了全面评估皮肤利什曼病诊断技术的现状与未来，研究人员开展了一项深入的文献综述。他们系统分析了传统的诊断方法（如显微镜检查、寄生虫培养）、血清学与免疫学测试（如直接凝集试验DAT、商业ELISA试剂盒）、基于PCR的分子诊断技术（包括实时荧光定量PCR-qPCR和微型PCR设备）、等温扩增技术（特别是环介导等温扩增LAMP和重组酶聚合酶扩增RPA），以及新兴的测序技术（如靶向测序和全基因组测序WGS）、人工智能（AI）辅助诊断和远程医疗（Telemedicine）应用。研究特别关注了这些技术在实际临床应用中的性能（灵敏度、特异性）、可操作性、成本效益，并与WHO的TPP和REASSURED（实时连接、样本易采集、可负担、灵敏、特异、用户友好、快速稳健、无需复杂设备、可送达终端用户）标准进行比对。研究还重点考察了针对不同利什曼原虫虫种（如L. tropica, L. major, L. aethiopica, L. braziliensis等）的诊断能力，并指出了在埃塞俄比亚等特定地区由于病原体遗传多样性高而面临的诊断挑战。
本研究的关键技术方法主要包括：1. 分子诊断技术评估，重点分析了以核糖体基因阵列（如18S rRNA, ITS1）、动基体DNA（kDNA）minicircle、热休克蛋白70（hsp70）基因为靶点的PCR和qPCR技术；2. 等温扩增技术深入评述，特别是环介导等温扩增（LAMP）技术的原理、引物设计（针对kDNA、hsp70等靶点）、检测方法（荧光、比色、浊度、侧向流动层析LFT）及其在便携式设备（如Loopamp试剂盒、miniPCR、Genie系列设备）上的应用；3. 对商业化和研究中的快速诊断测试（RDTs），如CL Detect免疫层析试纸条和基于CRISPR/Cas系统的检测方法进行了性能比较；4. 结合临床样本（来源包括巴基斯坦、阿富汗、埃塞俄比亚、巴西、哥伦比亚等多地）的研究数据，评估了不同采样方法（皮肤切口、牙髓针取样、微生物活检、胶带粘贴）对诊断灵敏度的影响。
传统诊断方法的局限性
传统的CL诊断主要依赖病变部位的视觉检查（湿性/干性溃疡）和显微镜涂片镜检。然而，临床症状与致病虫种关联性不可靠，例如在巴基斯坦的研究发现，临床表现为湿性溃疡（通常推测为L. major引起）的患者中，多数实际感染的是L. tropica。显微镜检查灵敏度较低（50%-70%），且需要专业技术人员。寄生虫培养可提高灵敏度但耗时长且易污染。血清学测试对CL诊断价值有限，因为CL感染体液免疫反应弱，且与恰加斯病、麻风病、结核病等存在交叉反应。
PCR-based方法的进展与挑战
PCR技术，特别是qPCR，是实验室进行利什曼原虫检测和虫种鉴定的金标准之一，对内脏利什曼病（VL）的诊断灵敏度可达90%，特异性达99.6%。然而，对于CL，尤其当使用非侵入性采样（如拭子）时，其灵敏度降至70%。此外，PCR需要昂贵的热循环仪和稳定的电力供应，限制了其在基层医疗点的应用。为了克服这些障碍，小型化PCR设备（如Palm PCR, miniPCR）被开发出来，有些可与侧向流动试纸条（LFT）或智能手机应用联用，实现快速结果判读。例如，一项研究显示miniPCR在检测VL样本时与参比qPCR法具有同等灵敏度（100%）。商业PCR试剂盒（如STAT-NAT, Real-TM, VIASURE）也已问世，但它们在储存条件（是否需要冷冻）和可检测虫种范围（能否覆盖新旧世界虫种）上存在差异。适应性PCR和微流控qPCR等新技术有望进一步缩短检测时间。
等温扩增技术（LAMP）的崛起
等温扩增技术，尤其是LAMP，因其操作简单（恒温反应，通常60-65°C）、快速（通常30-60分钟）、对设备要求低而成为POCT的理想选择。LAMP使用4-6条引物，特异性高，可通过浊度、荧光染料或颜色变化直接判读结果。针对利什曼原虫的LAMP assays通常靶向多拷贝基因如18S rRNA、kDNA minicircle或hsp70基因。例如，一项针对hsp70靶点的LAMP assay灵敏度达到100飞克（fg），约相当于一个寄生虫细胞的DNA量。LAMP还可与侧向流动层析（LAMP-LFT）或CRISPR/Cas系统结合，提高检测的便捷性和特异性。尽管大多数LAMP assay是属特异的，但已有研究成功开发出能鉴别L. donovani、L. major 和 L. tropica 的虫种特异性LAMP方法，检测限低至1-20 fg。重组酶聚合酶扩增（RPA）是另一种有前景的等温技术，反应温度更低（37-42°C），但试剂冻干可能更具挑战性。
测序、人工智能与远程医疗的新视野
靶向测序（如使用牛津纳米孔MinION平台）可用于虫种鉴定甚至发现混合或杂交感染。全基因组测序（WGS）则能更精确区分杂交体，并用于分子流行病学监测。人工智能在CL诊断中展现出两大应用方向：一是通过分析皮损图像进行视觉分类，在巴西、喀麦隆和哥伦比亚的研究中准确率高达93-96%，但在利比亚仅为70%，提示需要更多样化的训练数据；二是辅助显微镜检查，自动识别涂片中的寄生虫，准确率可达73%-99%。远程医疗和移动医疗应用（如WHO的SkinNTDs app，哥伦比亚和巴西开发的患者管理app）有助于加强患者随访、数据收集和医生培训，特别是在交通不便的地区。
迈向理想的POCT：现状与差距分析
尽管技术不断进步，但理想的、完全符合WHO TPP的CL诊断工具仍未普及。血清学快速检测试纸条CL Detect的灵敏度（68%）和特异性（94%）均未完全达标。LAMP技术显示出巨大潜力，基于LAMP的Loopamp试剂盒在CL诊断中表现出93%的敏感性和87%的特异性，接近TPP目标。便携式等温扩增设备（如Eiken的LF-160，价格约2000美元）的出现使现场检测成为可能。然而，重大挑战依然存在：首先，现有诊断工具（包括CL Detect和Loopamp）在埃塞俄比亚（主要病原体为L. aethiopica）表现显著不佳，灵敏度分别低至23-31%和48%，凸显了病原体遗传多样性对诊断准确性的关键影响，表明当前诊断方法开发未能充分覆盖所有流行虫种。其次，缺乏商业化的、经过充分验证的虫种特异性快速检测试纸条，这阻碍了针对不同虫种（其治疗策略和预后可能不同）的精准医疗。最后，将AI图像分析、等温扩增设备与远程医疗平台整合，形成一套完整的、具备实时连接和数据管理功能的诊断解决方案，仍需跨学科的合作和大量的现场验证。
综上所述，本研究系统回顾了皮肤利什曼病分子诊断领域的最新进展，指出等温扩增技术（尤其是LAMP）在实现WHO目标产品规范（TPP）目标方面展现出最大潜力。尽管在灵敏度、特异性和设备便携性方面取得了显著进步，但诊断工具在应对全球范围内利什曼原虫遗传多样性（特别是如埃塞俄比亚的L. aethiopica）方面仍存在不足，且虫种特异性现场快速检测工具缺位。未来的研究亟需聚焦于开发覆盖更广虫种谱系的检测方法，并在不同流行区进行大规模临床验证，同时推动AI辅助诊断、便携式核酸扩增设备与远程医疗系统的深度融合，以期在2030年前实现对所有CL病例进行有效诊断和管理的全球目标。
