延时比浊法 vs. 平板涂布法：细菌定量新方法在体内外感染模型中的性能评估与优势分析

《Microbiology Spectrum》：Performance of time-lapsed turbidimetry and agar plating as bacterial quantification methods

本文通过头对头比较，证实液体培养延时比浊法（liquid broth turbidimetry）在细菌定量中具有比传统平板涂布法（agar plating）更高的灵敏度与精密度。该方法在体外可检测更低密度的细菌，在体内小鼠肺炎模型中能更精确地区分野生型与Toll样受体4（TLR4）敲除小鼠的肺部及脾脏细菌载量差异，为感染动力学研究提供了更可靠的替代方案。

　　

INTRODUCTION

在微生物学研究中，精确的细菌定量对于理解感染动态、评估抗菌干预效果至关重要。目前，琼脂平板菌落形成单位（CFU）计数和液体培养延时比浊法（liquid broth turbidimetry）是两种广泛使用的定量方法。琼脂平板法被认为是某些应用的金标准，但其易受人为操作误差影响。相比之下，液体比浊法可实现高通量、实时监测，但两种方法在复杂实验环境下的相对性能尚缺乏系统性比较。

本研究旨在对这两种方法进行头对头比较，评估其在体外和体内环境下的性能。研究选取了肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等临床相关病原体，并在小鼠肺炎模型中验证了方法的适用性。

MATERIALS AND METHODS

细菌菌株与培养条件

研究使用了四种细菌菌株：肺炎克雷伯菌K2血清型（Kp43816）、肺炎克雷伯菌K1血清型（Kp396）、铜绿假单胞菌（PA01）和金黄色葡萄球菌（USA300）。所有菌株均在37°C、250 rpm的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中过夜培养。

琼脂平板法细菌定量

将过夜培养物进行10倍系列稀释（1:1至1:10,000,000,000），取10 μL涂布于LB琼脂平板，37°C培养18-24小时后手动计数菌落，计算CFU/mL。检测限定义为可观察到可辨别菌落的最大稀释度。

液体培养比浊法细菌定量

使用与平板法相同的培养物，在96孔板中进行10倍系列稀释（1:1至1:10,000,000,000），每个稀释度设3个技术重复。将96孔板置于37°C的酶标仪中，以30分钟为间隔，持续12小时监测600 nm处的光密度（OD₆₀₀）。使用Gen5数据分析软件，通过非线性回归模型拟合生长曲线，计算延滞期（lag time）。延滞期定义为从初始OD₆₀₀基线到指数生长期最大比生长速率点切线的时间轴截距。

小鼠肺部感染与组织收集

使用野生型（WT）和Toll样受体4敲除（Tlr4^-/-）小鼠，通过气管内滴注肺炎克雷伯菌K2血清型（Kp43816）建立肺部感染模型。感染后48小时处死小鼠，无菌收集肺和脾脏组织，用无菌PBS匀浆。

感染组织匀浆的细菌定量

组织匀浆分别通过琼脂平板法和液体比浊法进行细菌定量。琼脂平板法将组织匀浆进行系列稀释后涂板计数。液体比浊法将肺组织匀浆稀释100倍，脾脏组织匀浆稀释50倍，在96孔板中培养，通过监测OD₆₀₀计算延滞期。

统计分析

采用简单线性回归分析评估两种方法之间的相关性，计算决定系数（R²）。计算各稀释度下两种方法的平均标准误百分比（%SEM）以评估变异性。体内实验采用Welch校正的双尾t检验比较WT和Tlr4^-/-组间的差异，P < 0.05认为具有统计学意义。

RESULTS

体外琼脂平板法与液体培养比浊法的比较

研究比较了四种病原体（Kp43816、Kp396、PA01、USA300）的定量方法性能。以Kp43816为例，琼脂平板法在1:1至1:1,000,000稀释度范围内可检测到生长，检测限为8.1 × 10²CFU/mL。而液体比浊法在1:10,000,000稀释度仍可检测到生长，灵敏度比平板法高出约1个对数单位。两种方法在可量化范围内表现出强线性相关（R²= 0.9967）。此外，液体比浊法在几乎所有可比稀释度下的%SEM均低于或等于琼脂平板法，表明其具有更高的精密度。

对其他三种病原体（Kp396、PA01、USA300）的分析也显示出相似的趋势。液体比浊法在所有菌株中均表现出比琼脂平板法更高的灵敏度（检测限低10-100倍），且两种方法间存在强相关性（R²> 0.98）。液体比浊法的%SEM也普遍低于琼脂平板法，进一步证实了其更高的精密度。

体内小鼠组织细菌生长定量的比较

在体内实验中，研究人员比较了两种方法在区分WT和Tlr4^-/-小鼠细菌载量差异方面的能力。在肺组织匀浆中，琼脂平板法显示Tlr4^-/-小鼠的细菌载量有升高趋势，但无统计学差异（P = 0.0915）。而液体比浊法则检测到Tlr4^-/-小鼠的细菌载量显著高于WT小鼠（P = 0.0185）。

在脾脏组织匀浆中，两种方法均检测到Tlr4^-/-小鼠的细菌载量显著高于WT小鼠，但液体比浊法显示出更高的统计学显著性（P = 0.0002 vs P = 0.0339）。相关性分析显示，两种方法在肺（R²= 0.9318）和脾（R²= 0.9796）组织中均存在强线性相关。此外，液体比浊法的%SEM显著低于琼脂平板法，表明其在复杂生物样本中具有更低的变异性和更高的精密度。

DISCUSSION

本研究对传统琼脂平板法和液体培养延时比浊法在体外和体内实验模型中的细菌定量性能进行了比较分析。结果表明，尽管两种方法在体外对多种病原体的定量结果高度相关，但液体比浊法在检测限和精密度方面均表现出优势。

在体内实验中，液体比浊法能够更灵敏地检测到WT和Tlr4^-/-小鼠肺部和脾脏细菌载量的差异，显示出其在复杂生物系统中区分细微但具有生物学意义的细菌载量变化的能力。这种增强的灵敏度可能归因于液体培养法允许更大的初始样本体积在营养丰富的环境中孵育，从而提高了低密度活菌的检出率。

液体比浊法基于延滞期与初始活菌浓度成反比的原理，通过监测OD₆₀₀的变化来定量细菌载量。本研究在多种病原体和复杂体内样本中观察到的强线性相关性，为该方法在实验研究中的应用提供了实证支持。

尽管该方法具有诸多优势，但也存在一些局限性。例如，本研究仅针对需氧菌，未涉及严格厌氧菌；液体比浊法所需的设备投入也高于传统平板法。然而，液体比浊法在灵敏度和精密度方面的优势，使其成为体外和体内细菌学及感染研究中的一种有价值工具，特别是在需要可靠区分细菌载量细微差异的研究中。