《Microbiology Spectrum》：Six-year retrospective comparison of GeneXpert MTB/RIF Ultra PCR and culture for pediatric tuberculosis diagnosis in non-sputum samples
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本研究通过6年回顾性分析，证实GeneXpert MTB/RIF Ultra (GX-MTB/R-U)在儿童非痰标本中诊断结核病(TB)具有优异性能。结果显示，该检测灵敏度达95.1%，特异性达100%，显著优于传统培养和涂片镜检，为儿童结核病，尤其是肺外结核(EPTB)的早期、快速诊断提供了有力证据。
文章内容
ABSTRACT
儿童结核病(TB)的诊断因疾病菌量少及获取痰标本困难而充满挑战。这项为期6年的回顾性研究比较了GeneXpert MTB/RIF Ultra PCR (GX-MTB/R-U)检测（MTB/RIF PCR (GX-MTB/R)检测的改进版本）与常规分枝杆菌培养在儿童非痰标本中的诊断性能。来自一家三级儿科机构的417份非痰标本同时接受了GX-MTB/R-U和培养检测。以常规培养作为金标准评估性能，并通过临床回顾解决不一致的结果。当以培养作为金标准时，GX-MTB/R-U显示出93.9%的灵敏度和97.9%的特异性。通过患者临床回顾，确认了8份GX-MTB/R-U检测阳性但培养阴性的样本为真阳性，从而将灵敏度提高至95.1%，特异性提高至100%。与常规培养和镜检相比，GX-MTB/R-U表现出优异的诊断性能，尤其适用于菌量少和肺外标本。我们的研究结果支持将GX-MTB/R-U检测作为儿童结核病的一线诊断工具，而培养则保留用于确认PCR阴性结果和抗生素敏感性测试。
INTRODUCTION
结核病(TB)仍然是全球范围内发病和死亡的主要原因，2022年估计有130万例新发病例诊断于0-14岁儿童，其中包括11.5万例由耐多药菌株引起的病例。早期、准确的诊断至关重要，但由于该疾病通常菌量少、临床表现不典型以及幼儿无法咳出痰液，在这一人群中诊断具有挑战性。因此，必须提高从非痰标本（如胃液抽吸物、支气管肺泡灌洗液(BAL)、脑脊液(CSF)、淋巴结、骨骼、组织和其他肺外标本）中诊断儿童结核病的检出率。尽管肺外结核(EPTB)在儿科人群中占相当大比例，但目前的诊断金标准——分枝杆菌培养——在此背景下存在显著局限性。这些局限性包括周转时间长（长达42天）、灵敏度降低、需要专门培训、生物安全问题以及复杂的实验室基础设施，这可能导致诊断不足或治疗延迟。由于这些局限性，尽管结核病实验室诊断最近取得了进展，但临床症状、胸部X线摄影和接触史仍然是结核病诊断的基石。
快速分子诊断技术的引入，特别是世界卫生组织(WHO)认可的GX-MTB/R-U检测，通过提供更快、更灵敏的结核分枝杆菌复合群鉴定和利福平耐药性检测，显著推进了结核病检测，可在不到2小时内从痰标本中同时获得结果。大多数直接比较GX-MTB/R-U检测与传统培养在非痰标本中性能的大规模研究是在成年患者中进行的，关于儿科人群的可用数据有限。在儿科人群中进行的少数研究评估了GX-MTB/R-U检测在痰标本上的性能，这是该检测经FDA批准的标本类型。
这项回顾性研究旨在通过评估GX-MTB/R-U检测与常规分枝杆菌培养在卡塔尔一家三级儿科医疗机构6年间收集的417份非痰标本中的诊断性能，来弥补这一空白。
MATERIALS AND METHODS
Study design and setting
这项回顾性研究纳入了2019年1月至2024年12月期间，从0-18岁患者提交给我们Sidra Medicine微生物学实验室进行GX-MTB/R-U检测的所有非痰标本。Sidra Medicine是一家儿科三级护理医院，是卡塔尔国主要的儿科亚专科转诊中心。所有标本均收集在无菌容器中，并在收到后立即在我们的实验室进行检测。
Diagnostic tests
所有标本均使用GX-MTB/R-U检测在Sidra Medicine的微生物学实验室进行检测，并送交参比实验室进行结核培养。结核培养包括抗酸杆菌(AFB)涂片、使用补充了OADC富集物和PANTA抗生素混合物的BACTEC MGIT 960液体培养基，以及使用Lowenstein-Jensen斜面的固体培养基。培养物孵育42天。对于GX-MTB/R-U检测，所有标本均按照说明书中的描述，以与痰标本相同的方式进行处理。组织和活检标本在机械匀浆器中进行机械匀浆。无菌体液在室温下以5,000 × g离心15分钟，然后将沉淀物重悬于试剂盒提供的样本试剂中，比例为2:1，然后进行处理。所有结果均根据制造商的说明进行判读。
Statistical analysis
通过将检测结果与金标准结核培养结果进行比较，评估GX-MTB/R-U检测的性能。计算了GX-MTB/R-U检测的总体和标本类型特异性灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。使用Wilson评分法计算95%置信区间。使用阳性符合率(PPA)、阴性符合率(NPA)和Cohen's kappa系数评估检测方法之间的一致性。通过传染病医生进行临床回顾来解决不一致的结果。临床回顾包括对临床症状（如发热、咳嗽、体重减轻）、影像学发现、其他实验室检查、前往结核病流行地区的旅行史、对抗生素治疗的反应、卡介苗(BCG)接种史以及结核病病例接触史的回顾。经回顾临床表现与结核病一致的患者被归类为结核病真阳性。
RESULTS
Agreement between GX-MTB/R-U assay and culture
本研究共纳入来自296名独特患者的417份标本。79名患者有两份或更多标本。纳入本研究的患者中，153名(51.7%)为男性，中位年龄为6岁（四分位距[2-11]）。表1和表2显示了按标本类型划分的样本明细。在417份标本中，407份(97.6%)的GX-MTB/R-U检测和培养结果完全一致。GX-MTB/R-U检测产生39/417(9.3%)阳性结果，而培养产生31/417(7.4%)阳性结果。31份标本两种方法均为阳性，总体PPA为93.9%。376份标本两种方法均为阴性，总体NPA为97.9%。我们研究中使用的两种方法具有很强的一致性，Cohen's κ = 0.84 (0.76–0.94)，仅有10份标本显示不一致结果。来自同一患者的两份胃液抽吸物，培养阳性但GX-MTB/R-U检测阴性，经临床回顾确认为真阳性（表3）。另一方面，来自八名不同患者的八份标本（四份组织活检、两份淋巴结、一份脓肿和一份气管抽吸物），培养阴性但GX-MTB/R-U检测阳性，经临床回顾确认为真阳性（表3）。
Performance characteristics of the GX-MTB/R-U assay
GX-MTB/R-U检测相对于金标准培养结果的灵敏度、特异性、PPV和NPV如表1所示。通过患者病历临床回顾解决不一致结果后，GX-MTB/R-U检测的灵敏度、特异性、PPV和NPV如表2所示。总体而言，与金标准培养相比，GX-MTB/R-U检测表现出优异的性能，灵敏度为93.9%，特异性为97.9%，PPV为79.5%，NPV为99.5%。临床回顾不一致结果后，GX-MTB/R-U检测的性能进一步提高至灵敏度95.1%，特异性100%，PPV 100%，NPV 99.5%。标本类型的细分如表1和表2所示。在解决不一致结果后，GX-MTB/R-U检测阳性率最高的标本类型是淋巴结(28.5%)和组织活检(23.6%)。
Rifampicin resistance detected by GX-MTB/R-U assay
在39份GX-MTB/R-U检测阳性结果的标本中，仅有两份标本(5.2%)检测出利福平耐药。在所有检测的标本中，耐药率为2/417(0.5%)。这两个结果均通过相应阳性培养物在BACTEC MGIT 960上进行的抗生素敏感性测试得到确认。
AFB smear results
在研究的417份标本中，对415份(99.5%)进行了AFB涂片检查，其中16份(3.9%)产生阳性结果。与培养相比，AFB涂片显示出较差的灵敏度(40.6%)和优异的特异性(99.2%)。同样，经过临床回顾后，涂片显示出较差的灵敏度(40.0%)和优异的特异性(100%)。所有16份涂片阳性标本的GX-MTB/R-U检测结果均为阳性(PPA 100%)，其中13/16份涂片阳性标本培养也为阳性(81.2%)，后经临床回顾确认为真阳性。AFB涂片结果在16份培养和GX-MTB/R-U检测均为阳性的标本中呈假阴性。
DISCUSSION
儿童结核病的诊断具有挑战性，因为该疾病通常菌量少、痰标本难以获取，且传统结核培养的周转时间长。尤其令人担忧的是肺外结核(EPTB)比例较高，而培养检出率有限，且儿童，尤其是3岁以下儿童，进展为严重疾病形式（特别是结核性脑膜炎和粟粒性结核）的风险更高。我们研究的重点是为儿童结核病寻找一种可靠且更快的诊断检测方法，使用非痰标本。
与传统的培养相比，GX-MTB/R-U检测具有若干优势，包括在儿科患者不同部位标本中表现出优异的灵敏度和特异性，如本研究结果所示。在印度进行的一项规模较小的研究（包括171份肺外标本）揭示了与GX-MTB/R-U检测相当的结果，与培养相比，其灵敏度为88.9%，特异性为98%。值得注意的是，我们的结果优于一项系统评价和荟萃分析的结果，该分析考察了GX-MTB/R检测在八项研究中诊断儿科患者肺外结核的准确性。该系统评价显示，GX-MTB/R检测在纳入八项研究的652份儿科样本中，具有中等程度的汇总灵敏度71% (95% CI 0.63–0.79)和优异的汇总特异性97% (95% CI 0.95–0.99)。我们研究中较高的灵敏度可能归因于使用了2018年推出的GX-MTB/R检测的新超版本，该版本已证明比先前版本具有更好的性能。根据制造商的数据，该检测新超版本对结核分枝杆菌(H37Rv株)的估计检测限(LOD)为11.8 CFU/mL，而该检测旧版本的估计LOD为414 CFU/mL。一项包含19项研究、5,855份样本的系统评价显示，GX-MTB/R-U检测的汇总灵敏度(84%)始终高于先前版本的GX-MTB/R检测(汇总灵敏度: 69%)。
在我们的研究中，只有胃液抽吸物的灵敏度较低，为81.8%。这与之前在中国进行的关于胃液抽吸物的两项研究结果一致，他们报告的GX-MTB/R-U检测灵敏度为85%–87%。WHO的综合结核病指南强调，由于儿科人群中疾病菌量少，所有当前的结核病诊断检测在诊断儿童胃液抽吸物中的结核病方面均不理想。因此，阳性结果可准确诊断结核病病例，而阴性结果不能排除结核病的诊断。
在解决不一致标本后，GX-MTB/R-U检测检测出另外八份阳性标本，包括淋巴结和组织活检，这些标本在我们研究中的阳性标本中检出率最高，分别为28.5%和23.6%。这突显了使用GX-MTB/R-U检测以准确、快速的方式诊断此类宝贵标本中结核病的优势。在一项针对109份活检标本的研究中，GX-MTB/R检测在17份(15.6%)中呈阳性，灵敏度为73.9%，特异性为100%。如前所述，我们研究中较高的阳性率可能归因于使用了超版本检测，该检测显示出更高的灵敏度和改进的LOD。
GX-MTB/R-U检测的另一个优势是报告时间更快，不到2小时，而涂片通常在常规工作时间处理，结果通常在标本收集后24小时内无法获得，培养则可能需要长达42天才能获得最终报告。由于本研究的回顾性性质，我们无法评估GX-MTB/R-U检测对临床管理的影响。最近一项系统评价（考察了45项研究）发现，与结核涂片相比，GX-MTB/R检测平均将结核病诊断延迟缩短了1.79天，治疗启动延迟缩短了2.55天。
此外，GX-MTB/R-U检测显示出优于AFB涂片的灵敏度，并且能够检测出16例被AFB镜检漏诊的阳性病例。这与之前的研究一致，这些研究发现GX-MTB/R-U检测在非痰标本中的灵敏度远高于AFB涂片。在129名活动性结核病儿童中，胃液抽吸物GX-MTB/R-U检测的灵敏度为60.5%，而AFB涂片的灵敏度为10.9%。在一项评估187名儿童CSF样本的研究中，与AFB涂片相比，GX-MTB/R-U检测产生了更高的灵敏度(88% 对 2%)。在另一项评估106份淋巴结的研究中，GX-MTB/R-U检测显示出比AFB涂片更高的灵敏度(75.7% 对 5.4%)。尽管由于我们阳性标本中利福平耐药率较低(0.5%)，我们的研究无法评估GX-MTB/R-U检测利福平耐药性的准确性，这与卡塔尔报告的利福平耐药率一致，但与培养方法相比，在肺外结核标本中更快地检测利福平耐药性是该检测的另一个潜在优势，特别是在异烟肼和利福平耐药率均较高的环境中。之前在中国进行的一项系统评价研究（评估了11项研究中的3,801名患者）显示，在儿科患者中检测利福平耐药性具有优异的诊断性能，汇总灵敏度为94%，汇总特异性为99%。
尽管使用GX-MTB/R-U检测作为一线结核病诊断具有所有优势，但该检测并非适用于所有标本类型的完整解决方案，因为其在儿童中的证据较弱，且根据WHO的说法，不能完全取代培养。对于证据不足的标本类型，以及药敏试验，特别是怀疑耐多药结核分枝杆菌分离株时，仍推荐进行培养。此外，WHO强调，肺外标本分子检测阴性不能排除儿童结核病；因此，在这些情况下仍需要培养确认。
我们的研究有几个局限性。我们研究的回顾性性质限制了我们收集所有患者足够临床细节的能力；因此，该研究仅关注GX-MTB/R-U检测相对于传统培养的诊断性能。仅对不一致的标本进行了临床回顾，以根据其临床病史和进行的其他诊断方法（如影像学和实验室检查）确认他们是否确诊为结核病。另一个局限性是我们研究中包含的特定标本类型数量较少，特别是CSF和淋巴结组织，以及本研究中包含的几种标本类型没有GX-MTB/R-U检测阳性结果。这限制了我们对亚组分析的统计效力，并且无法计算特定标本类型的性能特征（如灵敏度），因为我们没有检测到任何真阳性。然而，一些先前的研究评估了其中一些特定的标本类型，并表明GX-MTB/R-U检测的性能与培养相当或更好。一项对儿科患者八项研究中646份淋巴结样本的系统评价显示，与培养相比，GX-MTB/R-U检测具有中等灵敏度(79%)和高特异性(90%)。另一项最近评估187名儿童CSF样本中GX-MTB/R-U检测性能的研究显示，其灵敏度(88%)显著优于GX-MTB/R检测和培养，后两者的灵敏度分别为34%和30%。
总之，我们的研究表明，GX-MTB/R-U检测是诊断儿童肺外结核的一种可靠且快速的方法。此外，该方法对于疑似肺结核但无法产生痰液的幼儿来说是一种有价值的诊断工具。需要更大规模的研究来评估GX-MTB/R-U检测在肺外标本，特别是无菌标本（如CSF、淋巴结和无菌部位）中的性能。
