NREM睡眠中神经调质系统的同步性：揭示多系统协调调控睡眠-觉醒新机制

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Synchrony of neuromodulatory systems during NREM sleep

本研究通过双位点光纤光度测量技术，首次在体揭示了NREM睡眠期间去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）和乙酰胆碱（ACh）三种主要神经调质在皮层和海马区释放的次慢波振荡（ISO, 0.02-0.03 Hz）存在高度同步性。研究发现，这种同步性在向微觉醒（MA）或完全觉醒过渡的振荡周期中显著增强。药理学抑制（如8-OH-DPAT、dexmedetomidine）和光遗传学激活实验进一步证实，不同神经调质系统的释放模式相互依存。该研究揭示了睡眠期间神经调质系统间重要的相互作用，为协调调控睡眠架构及睡眠相关神经过程提供了新机制。

　　

Synchrony of NE and 5-HT Releases during NREM Sleep.

为了研究睡眠-觉醒周期中大脑内NE和5-HT的释放模式，研究团队在野生型小鼠的内侧前额叶皮层（mPFC）注射AAV9-hSyn-GRAB_NE2m，在海马区注射AAV9-hSyn-GRAB_5-HT2h，以表达基因编码的荧光传感器。小鼠被植入两位点光纤光度测量探针以及脑电图（EEG）和肌电图（EMG）电极用于脑状态分类。结果再现了单胺类物质在睡眠-觉醒周期中的经典动态：觉醒期水平最高，NREM睡眠期显著降低，REM睡眠期最低。相关性分析发现，NE和5-HT在NREM睡眠期间的释放，在次慢波频率（~0.02 Hz）范围内高度相关，表现为频谱相干性增加。交叉相关分析进一步显示，NE和5-HT信号高度同步（滞后时间 < 1秒）。研究还确认了NE和5-HT信号与EEG纺锤波（sigma）功率在NREM睡眠期间呈负相关。通过交换脑区记录（如在mPFC记录5-HT，在海马区记录NE）或在同一脑区（海马）使用不同颜色的传感器同时记录，均验证了这种同步性及相似的滞后关系。在脑状态转换期间，NE和5-HT信号在睡眠向觉醒转换时大幅增加，在向NREM或REM睡眠转换时降低，在进入微觉醒时两者水平均升高。

Synchronized Release of ACh and Monoamines during NREM Sleep.

接下来，研究团队检测了ACh与单胺类物质（NE或5-HT）在睡眠期间的释放关系。使用AAV表达GRAB_ACh3.0来监测大脑中的ACh。当在mPFC记录ACh，在海马区记录5-HT时，发现ACh水平在觉醒期和REM睡眠期高于NREM睡眠期。相关性分析显示，ACh和5-HT在NREM睡眠期间的ISO存在同步性。交叉相关分析表明，ACh信号领先5-HT信号约2-4秒。这一领先-滞后关系在ACh与EEG sigma功率的分析中得到支持：ACh信号领先sigma功率（约2秒），而5-HT信号滞后于sigma功率（约2秒）。交换脑区记录（在mPFC记录5-HT，在海马区记录ACh）再次证实ACh信号领先5-HT信号2-4秒。在状态转换过程中，与5-HT相比，ACh在睡眠向觉醒以及NREM向微觉醒转换时上升更快，在觉醒向NREM睡眠转换时下降也更迅速。在NREM向REM睡眠转换时，ACh水平升高，这与REM睡眠期ACh动态的经典观点一致。

在检测NE和ACh同步性的实验中，在海马区记录的ACh释放模式与在mPFC观察到的相似。同步性分析显示NE和ACh的ISO在NREM睡眠期间同步，交叉相关分析表明NE信号滞后于ACh信号（2-4秒）。这一领先-滞后关系在两者均于海马区记录时得到确认。在睡眠向觉醒，特别是NREM向微觉醒转换时，ACh比NE更快达到峰值。在NREM向REM转换期间，两种信号出现分离，ACh升高而NE降低。这些数据揭示了NREM睡眠期间ACh和单胺类物质在皮层和海马区的同步释放。

Synchrony of Multiple Neuromodulatory Systems Promotes Arousal.

鉴于每个神经调质系统都能促进睡眠中的觉醒，研究团队探究了系统间的同步性是否有助于这一转换过程。利用NREM睡眠期间EEG sigma功率的ISO作为参考，并将神经调质释放与sigma波谷对齐，分析了导致不同结果（保持NREM、微觉醒、完全觉醒、进入REM睡眠）的NREM-ISO周期。研究发现，在导致从NREM睡眠到微觉醒再到完全觉醒的ISO周期中，NE、5-HT和ACh释放的振幅随着觉醒水平的提高而增加。与之相反，在向REM睡眠转换的周期中，单胺类物质（NE、5-HT）减少而ACh增加。配对相关性分析显示，在导致更高觉醒水平（微觉醒/觉醒）的ISO周期中，神经调质信号之间的皮尔逊相关系数和协方差均显著高于那些动物保持NREM睡眠的周期。线性回归分析进一步证实，同步性（尤其是协方差）可以预测NREM睡眠后的脑状态结果。这些数据表明，睡眠期间多个神经调质系统的振幅增加和同步性增强共同促进了觉醒。

ISO Requires Coordination of Neuromodulatory Systems.

针对不同神经调质ISO之间的跨区域同步性，研究通过药理学和光遗传学方法探讨了其协调机制。药理学实验使用5-HT_1A受体激动剂8-OH-DPAT抑制5-HT系统，以及肾上腺素能α₂受体激动剂dexmedetomidine抑制NE系统。结果发现，抑制任一系统（5-HT或NE）不仅消除了目标神经调质自身的ISO，也同时废除了其他神经调质（NE、5-HT、ACh）在NREM睡眠期间的ISO，表现为0.02 Hz附近的频谱峰值消失，并且神经调质与sigma功率之间的负相关关系也被消除。尝试使用毒蕈碱受体激动剂匹鲁卡品抑制胆碱能系统因导致长时间觉醒、缺乏NREM睡眠而未能评估其对ISO的影响。这些药理学数据表明，一种神经调质的ISO需要其他神经调质系统的协调作用。

光遗传学实验进一步验证了这种相互依赖性。在Dbh-Cre小鼠的蓝斑（LC）NE神经元或Slc6a4-Cre小鼠的中缝背核（DRN）5-HT神经元表达通道视紫红质2（ChR2），并在NREM睡眠期间给予低频（1 Hz）光遗传学刺激（该刺激参数本身不引起睡眠向觉醒的转换）。结果发现，在NREM睡眠期间（而非觉醒期间）激活LC-NE神经元，足以诱导海马区5-HT或ACh的释放，且不引起微觉醒（EMG振幅未变）或睡眠状态转换，但会像自发性ISO周期那样降低sigma功率。同样，在NREM睡眠期间激活DRN的5-HT神经元，也足以诱导mPFC的NE或海马区的ACh释放，且对觉醒状态或EMG无显著影响，但会降低sigma功率。这些结果表明，激活一个神经调质系统足以协调其他神经调质的释放，进一步证明了神经调质系统之间的相互依存关系。

Discussion

本研究描绘了NE、5-HT和ACh在睡眠-觉醒周期中的释放模式，通过两位点同时记录，揭示了NREM睡眠期间跨脑区的ISO同步性。这种同步性在导致觉醒的NREM-ISO周期中进一步增强。药理学和光遗传学实验证实了大脑中多种神经调质释放的协调性和相互依赖性。这些发现揭示了一种先前未被认识的睡眠期间神经调质释放模式。这种多神经调质系统的同步化ISO实现了对睡眠和觉醒的稳健调控，并可能有助于睡眠相关功能，如记忆巩固。

尽管光纤光度测量时间分辨率有限，但交叉相关分析提示NREM睡眠期间释放存在顺序：ACh > NE > 5-HT（ACh领先NE和5-HT约2-4秒，NE与5-HT滞后时间短于1秒）。这种行动序列可能对调节脑状态（特别是微觉醒和觉醒）具有生物学意义。药理学实验表明神经调质系统是相互依存的。关于一个系统如何调控另一个系统，存在直接和间接机制的可能性。已有证据支持NE对ACh系统、5-HT对ACh系统存在直接调制，而5-HT对NE系统的调控可能涉及间接通路。

药理学实验中观察到，抑制5-HT和NE系统对整体睡眠行为有不同影响（如Htr1a激动剂抑制NREM睡眠，Adra2a激动剂增加NREM睡眠），但两者都有效废除了NREM睡眠期间神经调质的ISO。这种对睡眠的不同影响可能与药物的非特异性作用、剂量效应以及这些调质受体在睡眠/觉醒相关脑区的复杂表达有关。光遗传学激活实验表明，在无状态转换的前提下，激活一个调质系统可诱导其他调质释放，且该效应在NREM睡眠期间特异，可能由于觉醒期高水平调质掩盖了弱刺激引起的小幅增加。

本研究的一个局限是缺乏对ACh系统的有效操纵。尝试使用匹鲁卡品因导致强烈觉醒而无法评估其对NREM-ISO的影响。未来通过光遗传学特异性操控胆碱能神经元有助于阐明ACh系统在调节NE和5-HT睡眠期释放中的作用。本研究主要在mPFC和海马区进行记录，鉴于神经调质系统的全局投射，这种同步性可能推广到其他脑区（如丘脑、下丘脑）。同步性现象引出了新的问题：什么信号启动了ISO？哪些脑功能需要睡眠期间多种神经调质的同步释放？未来需要在分子、环路和行为水平进行进一步研究。