《Proceedings of the National Academy of Sciences》：DNA mismatch repair mediated by Mlh1–Pms1 endonuclease-catalyzed mispair excision
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本研究通过体外重构实验，首次揭示了Mlh1-Pms1内切酶介导的错配修复（MMR）新机制。该机制不依赖于Exo1或Rad27，而是由Mlh1-Pms1在错配位点附近直接产生单链缺口，从而切除错配碱基。这一发现解释了Mlh1-Pms1在MMR中的普遍需求，并为理解其作为内切酶的直接功能提供了关键证据，完善了真核生物MMR的切除通路模型。
Mlh1-Pms1 Can Mediate an MMR Reaction Independent of Excision by Exo1 and Rad27.
为了探究不依赖于Exo1和Rad27的MMR机制，研究人员利用含有CC错配和5'缺口的质粒底物，在体外重构了修复反应。该反应体系包含Msh2-Msh6、Mlh1-Pms1、PCNA、RFC-Δ1N、RPA和DNA聚合酶ε（DNA Polε）。在仅含Mg2+的条件下，修复反应依赖于Exo1的存在。然而，当加入Mn2+（一种已知的Mlh1-Pms1内切酶激活剂）后，修复反应不再需要Exo1，表明Mlh1-Pms1的内切酶活性足以驱动修复。
进一步的分析证实了该反应的特异性。当使用错配识别缺陷的Msh2-Msh6(F337A)突变体、内切酶活性缺陷的Mlh1-Pms1(E707K)突变体，或省略PCNA和RFC-Δ1N（它们负责加载PCNA以激活Mlh1-Pms1）时，修复反应被完全消除。此外，省略DNA Polε（负责重新合成被切除的链）也阻断了修复。这些结果表明，该修复反应严格依赖于错配识别、Mlh1-Pms1的内切酶活性及其激活，以及DNA合成。
研究人员还测试了不同错配底物的修复效率。当使用Msh2-Msh6时，+T和+TGC错配被高效修复，而+ACGC错配修复效率极低。当使用Msh2-Msh3替代Msh2-Msh6时，+T错配修复效率略有下降，而+ACGC错配修复效率显著提高。这一结果与Msh2-Msh6和Msh2-Msh3的错配结合特异性一致，证明了该修复反应具有底物特异性。
Mlh1-Pms1 Mediated MMR Reactions Can Repair Substrates with 3′ Nicks.
为了验证该修复通路的通用性，研究人员测试了含有3'缺口的底物。结果显示，在含有Msh2-Msh6、Mlh1-Pms1、PCNA、RFC-Δ1N、RPA、DNA Polε、Mg2+和Mn2+的反应体系中，3'缺口底物也能被有效修复。当用低浓度的DNA聚合酶δ（DNA Polδ）替代DNA Polε时，也能观察到修复，尽管效率较低。由于低浓度的DNA Polδ无法进行有效的链置换合成以到达错配位点，这一结果进一步支持了Mlh1-Pms1介导的切除机制独立于链置换合成。
Mlh1-Pms1 Mediated MMR Reactions Use the Continuous Strand As a Template.
为了确认该反应是真正的MMR反应，即只切除有缺口的链，研究人员检测了修复的方向性。他们使用了含有TG错配的底物，该错配破坏了连续链上的XhoI位点和缺口链上的NsiI位点。修复产物的酶切图谱与连续链供体质粒的图谱完全匹配，而与缺口链供体质粒的图谱不匹配。这表明修复过程特异性地切除了缺口链，并以连续链为模板进行合成。对+T、CC和AC错配底物的测试也得到了相同的结果，证明了Mlh1-Pms1依赖的MMR具有绝对的极性，错配切除只发生在有缺口的底物链上。
Strand-Specific Nicks Generated by Mlh1-Pms1 Can Rescue PstI Cleavage At Mispairs.
在对照实验中，研究人员发现，在缺乏DNA聚合酶的反应中，含有+T错配的底物有少量能被PstI切割。他们推测，这可能是由于Mlh1-Pms1在错配附近产生的缺口促进了PstI的切割。通过使用寡核苷酸底物进行验证，他们发现，当“顶链”（含有+T的链）在错配5个核苷酸内有缺口时，PstI能够切割底物；而“底链”（不含插入的链）有缺口时，PstI则不能切割。此外，超螺旋质粒实验表明，PstI对含有+T错配的质粒具有“半位点反应性”，能够独立于Mlh1-Pms1切割底链。这些结果共同表明，Mlh1-Pms1在顶链上产生的缺口能够促进PstI对底链的切割，形成双链断裂，这提示Mlh1-Pms1在错配附近产生的切口可能有助于MMR的进行。
Mlh1-Pms1 Catalyzes the Formation of Single-Strand Gaps.
为了阐明Mlh1-Pms1如何在不依赖Exo1、Rad27或链置换DNA聚合酶的情况下切除错配，研究人员分析了在缺乏DNA聚合酶的情况下，由Mlh1-Pms1产生的DNA产物。他们发现，这些切除产物是环状的，能够被ScaI线性化。当用绿豆核酸酶（Mung Bean Nuclease，一种特异性切割单链缺口的酶）处理这些产物时，部分产物被切割成单位长度的线性DNA和一系列更小的片段。这种切割依赖于Mlh1-Pms1的内切酶活性，因为当省略Mlh1-Pms1或使用Mlh1-Pms1(E707K)突变体时，产物对绿豆核酸酶具有抗性。相比之下，一个含有26个核苷酸单链缺口的对照底物，经绿豆核酸酶处理后只产生线性DNA，而不产生小片段。这些结果表明，Mlh1-Pms1内切酶活性在底物DNA上产生了多个单链缺口和/或不同大小的缺口。
Mlh1-Pms1 Generates Two Patterns of Single-Stranded Gaps On Plasmid Substrates.
为了进一步表征缺口的形成，研究人员用限制性内切酶（如NotI）消化Mlh1-Pms1切除产物，通过监测对切割敏感的双链DNA转化为抗切割的含单链缺口的DNA来追踪切除过程。他们发现，NotI抗性产物DNA的量随着Mlh1-Pms1孵育时间的增加而增加。这种抗性产物的形成依赖于Msh2-Msh6的错配识别和Mlh1-Pms1的内切酶活性。此外，在含有+T、AC、TG或CC错配的底物中，均观察到了限制性内切酶抗性产物DNA的形成，并且这种抗性在ApaI、NspI和SacI等多种酶切位点都存在，表明Mlh1-Pms1在错配周围产生了广泛的单链区域。
Mlh1-Pms1 Catalyzes the Formation of a Broad Range of Single-Stranded Gap Sizes.
为了深入了解单链缺口的特征，研究人员通过电子显微镜（EM）直接观察了Mlh1-Pms1切除产物。他们用大肠杆菌单链DNA结合蛋白（SSB）染色单链区域，发现单链缺口的大小范围很广，从很小的缺口到几乎覆盖整个底物大小的缺口都有。虽然大多数含缺口的产物只包含一个缺口，但也观察到了含有2到6个缺口的产物。含有单个缺口的分子平均缺口长度为181纳米（约1553个核苷酸），而含有多个缺口的分子中的缺口往往更短，平均大小为37纳米（约317个核苷酸）。这些结果直接证实了Mlh1-Pms1能够催化产生大小不一的单链缺口。
Mlh1-Pms1 Generates Two Patterns of Single-Stranded Gaps On Plasmid Substrates.
为了精确绘制Mlh1-Pms1产生的单链缺口图谱，研究人员使用了单链DNA特异性胞苷脱氨酶APOBEC3A。他们用APOBEC3A处理Mlh1-Pms1切除产物，然后通过测序检测C > T的转换，这些转换只发生在被APOBEC3A脱氨的单链区域。
与Exo1切除对照（产生从NaeI切口位点开始、向5'-to-3'方向延伸的连续脱氨条带）不同，Mlh1-Pms1切除产物显示出两种不同的脱氨模式。大约60%的质粒含有短且通常是多个的脱氨条带（中位长度17个核苷酸），这些条带并不从NaeI切口开始，这与EM观察到的短单链缺口一致。另外约40%的质粒含有一个连续的脱氨条带，类似于Exo1产生的条带；这些条带从NaeI切口处或附近开始，向5'-to-3'方向延伸385至767个核苷酸，这与EM观察到的长单链缺口一致。
Discussion
本研究通过体外生化重构，首次证实了Mlh1-Pms1内切酶能够直接介导不依赖于Exo1和Rad27的错配切除。Mlh1-Pms1在错配附近产生链特异性的单链缺口，从而切除错配。这一发现揭示了MMR的第三条核心切除通路，与Exo1依赖通路和Rad27依赖通路一起，共同构成了真核生物MMR的完整切除机制，解释了Mlh1-Pms1在MMR中的普遍需求。
