《PLOS Computational Biology》：V-Cornea: A computational model of corneal epithelium homeostasis, injury, and recovery
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本文介绍了一种名为V-Cornea的基于智能体（Agent-based）的计算模型，该模型在CompuCell3D平台上实现，旨在模拟角膜上皮的稳态、损伤及恢复过程。该模型通过整合细胞增殖、分化、死亡等生物学行为规则以及关键信号通路（如EGF），成功再现了角膜上皮的层状结构，并预测了不同深度损伤的恢复时间。对于基底膜受损的中度损伤，模型揭示了其与复发性角膜糜烂（RCE）相似的动态结构紊乱，为理解角膜病理提供了新的机制性见解。该模型不仅为毒理学评估提供了无动物平台，也为药物发现和疗法优化提供了潜在工具。
1. 引言
角膜作为眼睛最外层的透明组织，不仅是视觉系统的主要屈光元件，也是抵御外部环境威胁的重要屏障。角膜损伤是常见的健康问题，通常由化学暴露、物理创伤或感染引起。目前评估眼刺激性的方法主要依赖于动物实验或简化的体外检测，这些方法通常只能提供组织损伤的静态快照，难以预测长期愈合结果，也无法有效区分浅表损伤（完全愈合）与深层损伤（伴有持续性并发症）。
为了克服这些局限性，研究人员开发了V-Cornea，这是一个基于智能体（Agent-based）的计算模型，旨在模拟人类角膜上皮的稳态、损伤及恢复过程。该模型通过为单个虚拟细胞编程，赋予其生长、运动、分化和死亡的生物学规则，从而准确构建并维持组织的层状结构和7-14天的更新周期。V-Cornea的最终目标是弥合体外实验与人体结果之间的差距，为毒理学评估、药物发现和疗法优化提供一个灵活、无动物的研究平台。
1.1. 当前角膜建模方法
现有的角膜计算机模拟通常采用三种主要方法：有限元分析（FEA）、偏微分方程（PDEs）模型和基于细胞的多细胞模型。FEA主要用于理解角膜的力学特性，将角膜视为具有弹性/粘弹性特性的连续组织，但缺乏对细胞成分的模拟。PDEs模型则用于预测化学或擦伤后的伤口愈合，通常将细胞群视为具有迁移和增殖速率的密度场。而多细胞方法则侧重于组织维持，研究不同参数如何影响角膜基底层的整体稳态和模式形成。
V-Cornea模型结合了上述方法的优点，将单个细胞行为的机制性规则与简化的化学信号和组织结构表示相结合，创建了一个能够统一研究角膜损伤和恢复动力学的单一平台。
1.2. 生物学背景
角膜上皮由4-8层细胞组成，分为四种主要细胞类型：角膜缘上皮干细胞（LESCs）、基底细胞、翼状细胞和表层细胞。LESCs位于角膜缘，是上皮更新的来源，它们分裂产生祖细胞，这些祖细胞向中央角膜迁移并分化。基底细胞是主要的增殖细胞，负责维持上皮的厚度。翼状细胞是中间过渡层，而表层细胞则形成最外层的保护屏障，最终通过脱落完成更新周期。
角膜上皮的稳态和修复受到多种因素的调控，其中表皮生长因子（EGF）是一个关键的信号分子。在损伤后，泪液中的EGF通过受损的上皮屏障扩散到组织中，刺激基底细胞增殖和迁移，从而促进伤口愈合。损伤的深度是决定愈合结果的关键因素。仅累及上皮层的浅表损伤通常在3-5天内完全愈合，而累及基底膜和基质的深层损伤则会导致愈合时间延长，并可能引发复发性角膜糜烂（RCE）等并发症。
1.3. V-Cornea模型的范围
V-Cornea模型目前主要聚焦于上皮层、泪膜和基底膜的简化表示。模型排除了角膜基质和内皮层的复杂细胞动力学，也简化了免疫反应，以便首先关注上皮再生的基本过程。这种简化使得模型能够计算可行，并准确捕捉上皮稳态以及轻微和轻度损伤后的成功恢复过程。
2. 方法与实现
2.1. 建模方法
V-Cornea采用基于智能体（ABM）的方法，在CompuCell3D平台上实现。该方法将每个细胞视为一个自主的智能体，遵循预设的规则与邻近细胞及其微环境进行交互。这种基于格子的方法能够有效捕捉角膜上皮稳态和伤口愈合所必需的协调细胞行为。
2.2. 模拟域与空间框架
模型模拟了角膜缘和周边角膜的二维径向矢状切面。模拟域是一个200×90像素的离散方形格子，每个像素对应2×2 μm的面积。该域代表了从角膜缘到中央角膜约400 μm的径向范围，模拟的上皮厚度约为50-52 μm，符合健康人角膜的生理范围。
2.3. 细胞组分与智能体表示
模型实现了四种不同的细胞智能体，分别代表角膜上皮的四种细胞类型：
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角膜缘上皮干细胞（LESCs）：位于角膜缘，具有增殖能力，分裂产生祖细胞。
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基底细胞：具有增殖能力，通过随机分裂平面维持组织分布。
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翼状细胞：非增殖性过渡细胞。
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表层细胞：形成保护屏障，具有有限寿命，最终通过概率性脱落机制被清除。
此外，模型还包含了几个关键的环境组分：
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泪膜：作为EGF的恒定来源，位于上皮表面。
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上皮基底膜（EpBM）：结合了生物学的上皮基底膜和Bowman层，分为低硬度的角膜缘区域和高硬度的中央区域。
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基质：被简化为一种固体材料，在损伤后阻止其他细胞进入。
2.4. 细胞行为与规则
细胞行为通过一系列编程规则来管理，包括分化、增殖、运动和死亡。
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生长动力学：细胞生长速率由局部EGF浓度和来自邻近细胞的机械约束决定。EGF依赖性生长速率使用Hill函数计算，而密度依赖性生长抑制则由另一个Hill函数表示。总生长速率是这两个因素的乘积。
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有丝分裂与细胞分裂：细胞分裂采用基于体积的调节系统。当细胞体积达到初始体积的两倍时，触发有丝分裂。LESCs的分裂平面定向于向心方向，而基底细胞的分裂平面则是随机的。
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分化：细胞分化是一个基于空间关系的规则过程。
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LESC向基底细胞分化：当LESC失去与角膜缘基底膜的接触时发生。
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基底细胞向翼状细胞分化：当与基底膜的接触面积低于定义的阈值时发生。
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翼状细胞向表层细胞分化：当翼状细胞到达最上层区域，接触泪膜并完全失去与下层（基底、干细胞或基底膜）的接触时发生。
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运动：细胞运动通过细胞Potts模型框架实现，细胞位置演化以最小化系统的哈密顿量。该能量包括接触能、体积和表面约束项以及趋化性项。
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细胞死亡与脱落：细胞移除有两种机制。自然脱落通过概率性方法发生，确保生理性的上皮更新率。损伤诱导的死亡则通过消融和化学暴露机制来模拟。
2.5. 泪膜与表皮生长因子（EGF）动力学
EGF被建模为使用反应-扩散系统的关键信号分子。泪膜作为上皮表面的恒定EGF来源。EGF浓度场根据扩散方程演化，并考虑了细胞类型依赖的扩散速率。表层细胞层形成高度选择性的屏障，其扩散系数较低，而基底层的扩散系数较高。这种屏障特性对于损伤模拟至关重要，因为表层细胞的损伤允许更多的EGF扩散到基底和干细胞，从而触发增殖和迁移反应。
3. 结果
3.1. 涌现行为与组织稳态
V-Cornea展示了从基本细胞规则中涌现出的复杂角膜上皮结构。模拟显示，从仅包含LESCs、泪膜和EpBM的初始状态开始，基底细胞增殖并向中央角膜迁移，翼状细胞作为中间体出现，促进层状结构的形成。到第7天，形成了具有所有细胞类型的完整分层结构，到第15天，组织达到了稳定的稳态状态，具有一致的层状组织和厚度。
3.2. 长期稳定性与组织结构
模拟在长时间内表现出稳定性。细胞群动态在多个模拟重复中保持一致，细胞计数分布呈钟形曲线，反映了受控参数内的自然生物变异性。Q-Q分析证实细胞计数分布与正态分布紧密对齐，证明了模型稳态的可重复性和统计可靠性。
模型通过两种互补的方法验证了组织厚度的生物准确性。质心差法计算了最深层细胞层与表层细胞层之间的距离，结果显示组织稳定在约50 μm，处于健康成人角膜中央上皮厚度的报告范围内。相对位置跟踪分析显示，从角膜缘到周边，所有节段的厚度变化高度一致，标准偏差仅为2 μm，表明组织结构高度均匀。
3.3. 细胞更新动力学
V-Cornea准确捕捉了角膜上皮中观察到的差异细胞更新率。周边角膜区域表现出更快的更新，几乎每7天发生一次完整的细胞替换，这与文献报道的角膜上皮每7-10天更新一次相符。相比之下，角膜缘区域表现出更渐进的更新率，与14天的更新周期一致。
3.4. 损伤模拟与恢复
为了评估模型模拟组织弹性和恢复的能力，研究人员引入了基于损伤深度分类系统的不同深度损伤。模拟揭示了与损伤深度相关的不同恢复模式。
对于仅限于上皮层的轻微和轻度损伤，观察到损伤后3-5天内完全上皮闭合。这一时间线与临床研究显示的人类浅表角膜擦伤通常在48-72小时内消退的结果一致。
相比之下，延伸到基质并损害基底膜的中度损伤产生了明显不同的结果。这些较深的损伤导致不完全恢复，上皮层持续中断，类似于复发性角膜糜烂（RCE）的临床模式。定量分析表明，轻微和轻度损伤的细胞群在5-7天内恢复到损伤前水平，并在此后保持稳定稳态，而中度损伤导致翼状细胞和表层细胞群在六个月的模拟中持续扰动。
这种类似RCE的行为源于模型中的特定机制。当基底膜被破坏时，基底上皮细胞无法与下层基质建立稳定的粘附，导致初始闭合后反复的上皮脱离。这种效应之所以出现，是因为基底膜具有双重关键功能：通过半桥粒为上皮细胞粘附提供底物，同时维持基底细胞处于未分化状态。当基底细胞失去与基底膜的接触时，它们会经历过早的终末分化，从而损害上皮完整性。
3.5. 模型验证与临床状况的关系
模拟结果与经验数据的一致性验证了模型的生物相关性。浅表损伤3-5天的恢复期与多项临床研究的结果平行，也与角膜上皮细胞的自然更新率一致。
更重要的是，尽管没有明确编程这种病理，但模型再现了复发性角膜糜烂（RCE）的关键方面。在临床RCE中，基底膜损伤破坏了半桥粒的形成和粘附复合物，导致持续的上皮缺损。该模型目前没有纳入基底膜再生的特定分子机制，这一限制反而提供了一个意想不到的好处——创建了一个可以独立于修复机制研究基底膜功能受损后果的系统。
4. 讨论
4.1. 研究结果的解释
V-Cornea证明，复杂的角膜上皮行为可以从相对简单的生物学规则中涌现出来。该模型在长时间内维持组织稳态，提供了令人信服的证据，表明基本的角膜上皮机制可以通过有限的核心细胞规则有效捕捉。模拟更新率与经验观察之间的高度一致性验证了这些基本规则准确反映了潜在的生物过程。
4.2. 对损伤的反应和恢复机制
V-Cornea模型通过模拟基于损伤严重程度的不同愈合反应，为组织损伤与恢复之间的机制关系提供了宝贵的见解。轻微和轻度损伤恢复时间的成功复制验证了EGF介导的愈合机制的实施。特别值得注意的是，上皮屏障破坏与通过增加EGF扩散加速愈合之间的涌现关系——这一现象是从基本细胞规则中自然产生的，而不是通过显式编程实现的。
更重要的是模型在模拟基底膜破坏时的涌现行为。最初看似是局限性——无法完全愈合中度损伤——实际上揭示了关于复发性角膜糜烂（RCE）等病理状况的宝贵见解。这些模拟表明，V-Cornea可以从相对简单的规则集中再现临床相关结果，使其成为理论和应用研究的宝贵平台。
4.3. 局限性与未来方向
尽管V-Cornea有效地模拟了急性角膜损伤反应，但有几个生物机制需要实施，以增强其在意外眼部暴露场景中的相关性。
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基底膜再生：将基底膜视为非再生实体是准确预测化学暴露恢复的关键限制。在急性损伤后，上皮细胞和基质角膜细胞通过协调作用再生基底膜——一旦实施这一过程，将显著改善对损害基底膜完整性的损伤的预测。
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化学损伤机制：当前模型对化学损伤机制的简化表示是第二个限制。化学暴露目前使用通用扩散模式和浓度依赖性细胞死亡阈值进行建模，没有纳入化学特异性作用模式或细胞选择性。
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泪膜动力学：泪膜动力学的简化表示是第三个关键限制。当前模型假设泪液产生和EGF水平恒定，而最近的研究表明这些因素在急性化学暴露后会迅速改变。
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基质和内皮层：排除基质和内皮层也限制了对化学损伤反应的全面评估，特别是对于穿透上皮层以外的暴露。
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维度限制：V-Cornea目前被实现为二维径向横截面，而不是角膜表面的完整三维表示。这种维度缩减允许捕捉局部深度和半径依赖的行为，但无法表示圆周现象。
未来的开发重点应放在实施基底膜再生机制、开发泪膜成分的动态模型、整合基质和内皮组织层，以及纳入炎症反应上。
5. 结论
V-Cornea有效地模拟了使用基于智能体建模方法的复杂角膜上皮行为，并采用了生物学启发的规则。该模型成功再现了角膜上皮动力学的关键方面，包括组织自组织、稳定结构的维持以及生理相关的细胞更新率。
该模型基于损伤深度预测不同愈合反应的能力代表了一项特别重要的成就。V-Cornea展示了通过准确再现轻微和轻度损伤的愈合时间，以及当基底膜破坏发生时模拟复发性角膜糜烂的涌现行为，来研究病理状况的潜力。这些能力从基本细胞规则中自然涌现，表明该模型捕捉了角膜伤口愈合动力学的本质特征。
通过其模块化的CompuCell3D实现，V-Cornea提供了一个可扩展的框架，研究人员可以将其应用于角膜生物学的各种应用。虽然当前版本尚未包括基底膜再生机制和更深层组织反应，但添加这些组件代表了未来发展的优先事项。
