推进用于废水处理的酶固定化技术：基于漆酶、金属有机框架（MOF）和氢凝胶的生物催化系统以实现可持续的染料脱色

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Advancing Enzyme Immobilization for Wastewater Remediation: Laccase-MOF-Hydrogel Biocatalyst System for Sustainable Dye Decolorization

本研究开发了一种新型高效环保生物催化剂（LAC@ZIF-8/Alginate），通过双步固定化策略将漆酶固定于ZIF-8纳米载体和alginate水凝胶复合基质中，显著提升对靛红和醋酸绿染料的脱色效率（94.8%和90.7%），并表现出优异的热稳定性、pH耐受性和循环稳定性（90%活性保留5次循环），为可持续废水处理提供创新解决方案。

　　

Oscar Amponsah|Karolina Labus

波兰弗罗茨瓦夫科技大学化学学院微纳与生物过程工程系，C.K. Norwida街4/6号，50-373弗罗茨瓦夫

摘要

基于酶的废水处理方法为传统方法提供了一种有前景的替代方案，但自由酶的使用受到其在处理条件下稳定性低和不可重复使用性的限制。固定化是克服这些限制的最有效策略之一。在现有的载体中，金属-有机框架（MOFs）因其可调的纳米结构、高表面积、孔隙率和优异的稳定性而受到关注。天然水凝胶由于其生物相容性和高保水能力，能够提供互补的水合环境，从而增强生物催化效果和可持续性。在本项目中，开发了一种新型、高效且环保的生物催化剂（LAC@ZIF-8/Alginate），用于高效去除靛蓝胭脂红（IC）和酸性绿（AG）染料。首先将漆酶吸附到ZIF-8上，然后将其包裹在藻酸盐基质中。这种双重结构结合了ZIF-8的纳米级特性和吸附能力以及藻酸盐的保护性宏观环境，形成了一种坚固、可重复使用且功能性的生物复合材料，适用于废水处理。FTIR分析证实了漆酶的成功固定化，而光谱测定显示其催化性能优于自由酶，同时具有更好的热稳定性和pH耐受性，以及更高的操作和储存稳定性。经过五个ABTS基反应循环后，戊二醛交联的LAC@ZIF-8/Alginate仍保持超过90%的活性，其中IC的脱色率达到94.8%，AG的脱色率达到90.7%。这些结果突显了MOF-水凝胶混合载体作为下一代可持续生物催化剂平台的潜力，有助于改善废水处理效果。

引言

含有染料的工业废水的排放仍然是一个紧迫的环境问题。据估计，仅纺织工业就导致了全球约20%的废水污染[1],[2]。这些有色化合物会破坏水生生态系统，并在环境中长期存在[3],[4]。传统的处理系统往往无法有效去除高度稳定的染料分子，受到高运营成本、高能耗和产生有毒污泥等限制[5]。基于酶的处理方法作为一种有前景的替代方案，具有最小的环境影响和能耗[6]。其中，漆酶是一种非常有前途的酶，它能够降解持久性污染物，如有毒工业化学品、药物、微塑料和工业染料等[7]。然而，自由酶的实际应用常常受到不稳定性、不可重复使用性和易变性的阻碍。固定化通过将酶限制在载体中，提供了结构保护、操作稳定性和酶的回收便利，从而解决了这些问题。载体材料对酶-底物相互作用和质量传递有重大影响，因此其选择是生化工程中的核心关注点。

近年来，已经探索了多种载体系统，包括天然聚合物（如壳聚糖、纤维素等）、无机氧化物和合成聚合物。在新兴的载体中，金属-有机框架（MOFs）是一个重要的突破。这些高孔隙率的结晶纳米材料通过金属离子或金属簇与有机配体的配位组装而成，具有优异的稳定性、最佳的吸附性能和可控的扩散特性，这对于生物催化应用至关重要[8],[9]。基于Zr的MOFs（如DUT-5和UiO-66）、基于Fe的MOFs（如Fe-BTC）以及分级多孔MOFs等已被广泛报道为理想的酶载体材料[10],[11]。金属节点和有机连接体的多功能性使其能够在生物传感、工业生物催化、环境修复、可持续CO₂转化和废水处理等领域发挥重要作用[12],[13],[14]。

特别是沸石咪唑框架-8（ZIF-8）这种基于Zn的MOF，被广泛用于通过吸附、包裹/封装和共价结合来固定酶，以提高酶的稳定性和保持其生物催化性能。其独特的3D笼状结构可实现快速电子转移，超高的孔隙率和大的表面积支持高效的质量传递和酶负载，使其适用于生物催化氧化、光催化、电催化和电化学应用[15],[16]。然而，当以粉末形式单独使用时，纳米级形态会导致聚集、难以从反应介质中分离以及潜在的酶泄漏，这在大规模应用中带来挑战[17]。为了解决这些问题，研究人员探索了改性策略和混合系统（表1）。将MOFs结合到亲水性聚合物基质（如水凝胶）中，这些基质是能够在水溶液中膨胀的三维交联网络，可以促进分子相互作用和质量传递。基于藻酸盐的水凝胶因其稳定的交联“蛋盒”结构而脱颖而出，能够保护酶免受不利反应条件的影响[18]。然而，当作为单一载体使用时，水凝胶也存在一些扩散限制、酶泄漏和在连续流动系统中的机械强度不足等问题[17],[19]。

虽然每种材料都有其独特的优势，但混合使用往往能产生更好的性能。许多研究集中在基于MOF或水凝胶的载体上，但这些载体都受到各自局限性的制约，因此仍存在显著的研究空白。本研究通过结合ZIF-8和藻酸盐，提出了一种新的漆酶固定策略，旨在实现协同效应，克服限制并利用各自的优势，获得一种坚固且环境友好的生物催化剂。这种双重方法为酶法废水处理提供了可持续的途径：ZIF-8纳米级载体用于高酶负载，采用吸附作为简单且经济有效的固定方法；基于藻酸盐的水凝胶作为第二层宏观层，提高稳定性，并将酶-MOF纳米颗粒嵌入宏观珠中，便于从反应介质中回收催化剂并实现重复使用[20],[21],[22]。水凝胶网络起到支架作用，防止聚集，而MOF同时作为纳米填料，增强相对较软的水凝胶的耐久性。

我们研究的主要概念是开发并表征一种基于漆酶的固定化生物催化剂，充分利用两种组分的固有功能。ZIF-8有助于从液相到固相高效吸附和浓缩染料分子。藻酸盐基质进一步在基质内部富集染料分子，使其靠近ZIF-8固定的漆酶，从而实现快速吸附和高效染料转化的协同效应，显著提高废水处理的整体效率。假设这种方法将能够创造出具有优异催化性能、操作稳定性和工业相关条件下更高稳定性的固定化生物催化剂，使新型LAC@ZIF-8/Alginate成为下一代可持续废水处理工具。

材料

来自Myceliophthora thermophila的漆酶在Aspergillus oryzae中表达；ABTS（2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）、Lowry试剂、Folin试剂、2-甲基咪唑、戊二醛（GA）溶液（Grade II，25% H₂O）、六水合硝酸锌[Zn(NO?)?·6H?O]、海藻酸钠、酸性绿（AG）和靛蓝胭脂红（IC）均由SIGMA-ALDRICH（美国）提供。无水氯化钙（CaCl₂）从EUROCHEM BGD Sp. Tarnow（波兰）购买。无水硫酸铜（II）

漆酶在ZIF-8上的吸附

根据方法（3.2.4节），ZIF-8的合成涉及将5.85克Zn(NO₃)₂·6 H₂O和113.50克2-甲基咪唑分别溶解在40毫升和400毫升去离子水中。这一过程产生了8.94克符合ZIF-8特性的结晶多孔材料，适用于漆酶的固定化。为了验证吸附作为固定漆酶的有效性，进行了三种不同浓度的实验

所开发生物复合材料的环保考虑

LAC@ZIF-8/Alginate生物复合材料提供了一种高效且环保的生物催化系统，适用于废水处理。该酶在温和的水性条件下降解污染物，具有高底物特异性，减少能量需求和有害副产物的生成。我们的研究结果证实，该酶在多次应用循环中仍保留在基质中，从而减少了总体酶的使用和过程成本

未来方向

本研究开发的生物催化剂（LAC@ZIF-8/Alginate生物复合材料）表现出高催化性能和优异的稳定性。然而，一个关键观察结果为未来的研究指明了方向：连续应用循环中功能的逐渐下降需要详细研究该生物复合材料的吸附-解吸动态，以优化多次脱色过程。这样的研究可能有助于深入了解生物复合材料与副产物之间的相互作用机制

结论

本研究成功探索了用于高效降解废水中污染物的酶固定化概念。主要目标是将漆酶固定在天然基载体上，以提高其从水溶液中可持续且环保地去除选定纺织染料的工程潜力。为此采用了两步固定化策略。所采用的程序不仅保留了大部分酶，还持续增强了其性能

资助

本研究得到了欧盟Erasmus Mundus联合硕士项目“可持续生物质和生物产品工程”（项目编号101050789 Sus2BioEng）的支持。

CRediT作者贡献声明

Karolina Labus：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目管理、方法学研究、资金获取、概念构思。 Oscar Amponsah：撰写——初稿撰写、可视化展示、验证、研究实施、资金获取、数据分析。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究是基于Oscar Amponsah的硕士项目进行的扩展研究，在PhD工程师Karolina Labus的指导下完成。作者衷心感谢欧盟Erasmus Mundus联合硕士项目“可持续生物质和生物产品工程”（项目编号101050789 Sus2BioEng）为这项研究提供的财务支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突