《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：Cationic liposome-based silencing of thioredoxin reductase-1 for sensitization of MDA-MB 231 cells to gamma radiation
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本研究利用阳离子脂质体介导的TrxRd1基因沉默技术，探讨其对MDA-MB 231乳腺癌细胞放射敏感性的影响。通过合成不含有机溶剂的绿色化学制备脂质体，证实其能有效递送shTrxRd1短发夹RNA并显著降低TrxRd1表达（>75%）。基因敲除后，γ射线处理下细胞内ROS水平显著升高，伴随细胞存活率下降（P<0.01）、集落形成能力减弱及凋亡率增加，表明TrxRd1抑制可通过ROS介导机制增强放疗敏感性。脂质体具有稳定的亚微米尺寸（80-100 nm）和良好的包封效率，为后续临床应用提供了安全有效的递送平台。
Sandeep B. Shelar | Manideepa Basu | P.A. Hassan | K.C. Barick
印度孟买Trombay的Bhabha原子研究中心化学部，邮编400085
摘要
硫氧还蛋白还原酶1（TrxRd1）是一种广泛保守的抗氧化酶，通过还原氧化的硫氧还蛋白1（Trx1）来维持细胞内的氧化还原平衡。TrxRd1的过表达与癌细胞的放射抗性直接相关。在本研究中，我们探讨了阳离子脂质体介导的TrxRd1敲低对MDA-MB 231乳腺癌细胞放射敏感性的影响。阳离子脂质体使用二癸基二甲基溴化铵（DDAB）作为表面活性剂，大豆卵磷脂作为脂质成分，通过超冷胶束法制备。这些脂质体通过静电相互作用与编码短发夹RNA（shTrxRd1）的质粒DNA结合。通过测量流变尺寸、表面电荷和等温滴定量热法确认了脂质体-DNA复合物（DDAB-shTrxRd1）的形成。通过细胞质中的碘化丙啶（PI）定位和绿色荧光蛋白（GFP）的表达证明了细胞摄取，而TrxRd1 mRNA水平的降低证实了基因沉默。TrxRd1的敲低导致γ射线照射后的细胞中活性氧（ROS）水平升高，伴随细胞活力下降、菌落形成减少和凋亡增加，表明TrxRd1抑制后MDA-MB 231细胞的放射敏感性增强。总之，通过阳离子脂质体基因沉默靶向TrxRd1可以增加乳腺癌细胞的放射敏感性，从而促进ROS的积累。
引言
氧化还原敏感的细胞信号传导在调节多种细胞过程中起着关键作用，如增殖、细胞周期进展和促生存信号通路[[1], [2], [3], [4]]。这些细胞过程的失调，特别是细胞周期的紊乱，会促进细胞的无限制增殖、去分化以及凋亡机制的受损，从而促进癌变[[5,6]]。已知活跃增殖的细胞会产生活性氧（ROS），这些ROS参与多种细胞内信号传导和代谢途径。癌细胞维持着失调的氧化还原平衡；虽然适量的ROS支持肿瘤发生，但过高的ROS浓度会超出细胞的抗氧化能力，导致细胞毒性[[3,7,8]]。因此，维持氧化还原平衡至关重要，细胞配备了复杂的生物化学和遗传系统来保持这种平衡。重要的是，癌细胞进化出了适应机制，使其能够在氧化应激条件下存活，这些条件偏离了还原环境。这是通过上调抗氧化途径实现的，使肿瘤细胞能够利用ROS介导的信号传导进行增殖，同时将ROS水平维持在不会引发衰老或凋亡的阈值以下[[9,10]]。特别是，硫氧还蛋白抗氧化系统在不同类型的癌细胞中通常被上调。硫氧还蛋白系统普遍存在于大多数生物体中，是高等真核生物生存所必需的关键抗氧化机制。该系统包括一组大小约为12 kDa的小蛋白质，称为硫氧还蛋白（Trxs），以及硫氧还蛋白还原酶（TrxRd）。TrxRd催化氧化的Trx还原为还原态的Trx[[11], [12], [13]]。
早期研究报道，在肺癌、胃癌和乳腺癌中Trx1的表达水平升高。Trx1在乳腺癌的起始和进展中起重要作用，尤其是在细胞转化和侵袭性方面[[14], [15], [16], [17]]。稳定转染了表达氧化还原失活Trx1突变体的乳腺癌细胞表现出显性负效应，导致恶性表型的逆转。在SCID（严重联合免疫缺陷）小鼠中的异种移植研究表明，肿瘤发生受到抑制，且没有证据表明肿瘤向远处器官转移[[18,19]]。这些发现强调了Trx1氧化还原活性在维持乳腺癌细胞的转化和肿瘤发生状态中的关键作用。此外，乳腺癌患者血清中Trx1浓度升高，表明分泌的Trx1可能通过肿瘤微环境中的自分泌和旁分泌信号通路调节肿瘤进展[[20,21]]。在MDA-MB-231细胞中，氧化还原活性Trx1的过表达导致MMP-9上调和侵袭性增强，而表达氧化还原失活的Trx1突变体则抑制了MMP-9水平，显著降低了侵袭性，突显了Trx1介导的转移调控的氧化还原依赖性[[14,22]]。
最近的研究表明，硫氧还蛋白还原酶1（TxRd1）的上调与肿瘤进化、转移和生存率下降高度相关[[23], [24], [25]]，而使用吲哚醌和auranofin等化学抑制剂消除TrxRd1在脑癌中表现出抗转移特性[[26,27]]。TrxRd1系统的上调也与接受放疗的癌细胞的放射抗性相关，其中细胞杀伤是通过直接DNA损伤和ROS生成的间接细胞毒性实现的[[28,29]]。microRNA-124被发现可以调节放射抵抗性肺癌中TrxRd1的表达，在放射抵抗性癌细胞中microRNA-124通过上调TrxRd1的表达而下调[[30]]。使用姜黄素、auranofin和吲哚醌等TrxRd1的化学抑制剂治疗显著改善了小鼠模型中胶质瘤、前列腺癌和乳腺癌的放疗反应和生存率[[26],[31],[32],[33],[34],[35]]。然而，TrxRd1的化学抑制剂具有非特异性，可能会与其他细胞大分子相互作用，导致不必要的副作用[[36],[37],[38]]。因此，通过基因操作特异性耗尽TrxRd1可能是促进癌细胞放射敏感性的更安全方法。使用阳离子脂质体介导的基因递送通过基因敲低TrxRd1来增强乳腺癌细胞的放射敏感性尚未得到广泛研究。与化学抑制剂不同，基因操作可以特异性地敲低目标蛋白，避免不必要的细胞毒性。
在本研究中，我们使用不含有机溶剂的阳离子脂质体（通过超冷胶束法制备）探索了TrxRd1敲低对MDA-MB 231乳腺癌细胞放射敏感性的影响，这些脂质体能够有效递送阴离子活性成分（如干扰RNA）。含有针对TrxRd1的短发夹RNA（shTrxRd1）的质粒DNA被封装在阳离子脂质体中并转染到MDA-MB 231细胞中。通过基因表达研究TrxRd1的敲低情况，并使用氧化还原敏感染料DCFDA测量ROS的增加。通过细胞活力、菌落形成和凋亡测定研究了它们的放射敏感性效果。
材料
Phospholipon-90H（大豆卵磷脂）购自德国Lipoid公司。二癸基二甲基溴化铵（DDAB）、果糖、甘油、丁醇、结晶紫、2′,7′-二氯荧光素二乙酸盐（DCFDA）和凋亡测定试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、青霉素/链霉素/两性霉素B抗生素混合物、胎牛血清（FBS）和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物（MTT）也来自相同公司。
阳离子脂质体的合成与表征
阳离子脂质体是通过不使用有毒和易燃有机溶剂的方法合成的，具体方法如图S1所示，使用糖/糖醇（果糖）、脂质（Phospholipon 90H）、变性剂（甘油）和阳离子乳化剂（DDAB）通过超冷胶束法制备。通过研究其结构形态、大小和表面电荷确认了阳离子脂质体（DDAB）的形成。
讨论
本研究成功地使用不含有机溶剂的方法合成了阳离子脂质体，该方法使用了生物相容性成分，如果糖、甘油、Phospholipon 90H和DDAB，避免了有害有机溶剂的使用。该过程利用了超冷胶束形成技术，提供了一种更安全、更环保的脂质体制备方法，符合绿色化学原则[[41,42]]。通过冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）的结构表征证实了单层脂质体的形成。
结论
本研究展示了使用不含有机溶剂的方法成功合成了基于DDAB的生物相容性阳离子脂质体，该方法符合绿色化学原则。这些脂质体表现出优异的结构稳定性、良好的物理化学性质，并通过静电相互作用有效地结合DNA，实现了超过75%的TrxRd1表达敲低，证实了它们的潜力。
CRediT作者贡献声明
Sandeep B. Shelar：撰写原始草稿、方法学设计、实验实施、数据分析、概念化。
Manideepa Basu：实验实施、数据分析。
P.A. Hassan：项目管理、资金获取、监督。
K.C. Barick：撰写、审稿与编辑、验证、监督、资源协调。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢Bhabha原子研究中心纳米治疗与生物传感器部门的S. N. Sawant博士和化学部的N. Choudhury博士提供的持续支持和鼓励。作者还感谢RB&HSD部门的S. G. Shinde先生协助进行γ射线照射实验。同时感谢BARC的Santosh Gawali博士和Sun Pharmaceuticals Ltd.的Ajay Khopade博士协助进行CryoTEM成像。
