双嘧达莫通过调控cGMP-PKG信号通路改善NPC1小鼠海马功能的多组学研究

《Brain Research Bulletin》：INVESTIGATION OF DIPYRIDAMOLE-ELICITED SIGNALING IN THE BRAIN OF NIEMANN PICK TYPE C MICE: A MULTI-OMIC STUDY

本研究针对尼曼匹克C型（NPC1）这一罕见致命性疾病治疗手段匮乏的现状，探讨了已获批抗血小板药物双嘧达莫（DIP）在NPC1小鼠模型中的治疗潜力及区域特异性机制。研究人员通过整合转录组学和蛋白质组学分析，发现DIP能特异性激活海马区cGMP-PKG信号通路并改善线粒体功能，从而挽救认知记忆缺陷，但对小脑功能无显著影响。该研究为DIP应用于其他伴有海马及线粒体功能障碍的神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）提供了理论依据。

　　

在罕见病研究领域，尼曼匹克C型（Niemann-Pick type C, NPC1）疾病如同一道难解的谜题。这是一种由NPC1或NPC2基因突变引起的致命性神经visceral脂质贮积症，其特征是胆固醇和其他脂质在细胞内endo-lysosomal（EL）区室中异常蓄积。这种蓄积引发了一系列连锁反应：钙稳态失调、线粒体功能受损、自噬流障碍，最终导致神经系统进行性退化，特别是小脑和海马区域受累最为显著。更令人忧心的是，目前欧洲范围内针对NPC1的治疗选择极为有限，米格鲁斯塔（miglustat）是唯一获批药物，L-乙酰亮氨酸也仅是近期才获得欧洲药品管理局的上市许可。因此，寻找新的有效治疗方法迫在眉睫。

以往的研究发现，腺苷能系统在NPC1的病理过程中扮演着重要角色。腺苷是一种神经调质，其细胞外水平受到酶和跨膜转运体（如平衡型核苷转运体ENTs）的精密调控，以维持其通过G蛋白偶联受体（AR）正常转导信号通路。特别是腺苷A_2A受体（A_2AR）的激活，在体外和体内的NPC1模型中都显示出改善病理表型的潜力。基于此，研究团队将目光投向了双嘧达莫（Dipyridamole, DIP），一种老牌的抑制血小板聚集的药物。DIP具有双重作用机制：一方面，它可以抑制ENT1，从而提高细胞外腺苷水平，间接增强AR信号；另一方面，它能够抑制磷酸二酯酶（PDE），增加细胞内环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟苷（cGMP）的水平。前期体外实验证实，DIP能够通过激活A_2AR来减少NPC1成纤维细胞内的胆固醇蓄积并改善线粒体膜电位。然而，在NPC1小鼠模型中，DIP虽然改善了海马依赖性的识别记忆，并增加了海马钙结合蛋白（calbindin）的表达，却对小脑依赖的运动功能无改善作用。这种区域特异性的效应背后的分子机制尚不清楚。

为了揭开DIP在大脑中区域特异性作用的神秘面纱，由Tait Sabrina、Fratini Federica、Boussadia Zaira、Gaddini Lucia、Marra Manuela、Le Pera Loredana、Venturini Gloria和Ferrante Antonella组成的研究团队在《Brain Research Bulletin》上发表了他们的最新研究成果。他们采用了一种强大的综合研究策略——多组学分析，结合RNA测序（RNA-seq）和基于质谱的蛋白质组学，系统性地比较了经DIP治疗的NPC1缺陷（Npc1^-/-）小鼠与未治疗的NPC1缺陷小鼠（Npc1^-/-Veh）以及健康对照小鼠（Npc1^+/+Veh）在海马和小脑两个关键脑区的基因和蛋白表达谱。这项研究旨在从分子层面阐释DIP为何能“偏爱”海马，而“忽视”小脑。

关键技术方法概述

本研究的关键技术方法主要包括：1）使用BALB/cNctr-Npc1^m1N/J品系的NPC1小鼠模型，对Npc1^-/-小鼠从出生后第28天（PND28）开始腹腔注射DIP（30 mg/kg）或Vehicle，持续治疗至PND63-65后取材。2）分别从海马和小脑组织中提取总RNA和总蛋白。3）转录组学分析：使用Ion S5?系统和Ion AmpliSeq? Transcriptome Mouse Gene Expression Kit进行RNA测序，生物信息学分析包括质量控控、序列比对、差异表达基因（DEGs）鉴定（使用edgeR软件，阈值设定为FDR < 5%且 |log2FC| > 1）以及功能富集分析（使用ClueGo进行KEGG通路富集分析）。4）蛋白质组学分析：采用数据非依赖采集（DIA）质谱技术进行蛋白质鉴定和定量，使用FragPipe软件套件（包含MSFragger, DIA-NN等）进行数据分析，差异表达蛋白（DEPs）的筛选标准与转录组类似，并进行功能富集分析。5）整合分析：将DEGs和DEPs列表合并进行功能富集和蛋白互作网络（PPI）分析（使用STRING数据库）。6）Western Blotting验证：对关键蛋白CD68和PKG1进行免疫印迹验证。7）长链非编码RNA（lncRNA）互作网络分析：利用公共数据库预测差异表达lncRNA与mRNA/蛋白的相互作用。

研究结果

3.1. 差异表达基因（DEGs）分析

3.1.1. 鉴定Npc1^-/-小鼠脑中相对于Npc1^+/+小鼠的DEGs

转录组分析显示，与健康对照相比，NPC1缺陷导致海马和小脑的基因表达发生广泛改变。小脑的DEGs数量（1041个）远多于海马（589个），且两个脑区均以基因上调为主。值得注意的是，约有10%（海马）和8%（小脑）的DEGs是长链非编码RNA（lncRNAs），提示lncRNAs可能参与NPC1的病理过程。两个脑区仅有254个（占总DEGs的18.5%）共同的DEGs，表明NPC1缺陷对海马和小脑的转录组影响存在显著的区域差异性。

3.1.2. 鉴定DIP治疗后Npc1^-/-小鼠脑中的DEGs

DIP对转录组的影响具有明显的区域特异性。在小脑中，DIP仅引起29个DEGs的微小变化。相比之下，在海马中，DIP诱导了94个DEGs的变化，其中80%为上调。特别有趣的是，当比较DIP对NPC1缺陷小鼠转录组的纠正效应时，发现DIP能够逆转大部分（海马25/26个，小脑13/13个）在NPC1缺陷背景下异常表达的基因，使其表达水平向正常方向回调。这表明DIP在海马中发挥了部分“纠偏”作用。

3.2. 差异表达蛋白（DEPs）分析

3.2.1. 鉴定Npc1^-/-小鼠脑中相对于Npc1^+/+小鼠的DEPs

与转录组结果不同，蛋白质组学显示NPC1缺陷在海马和小脑中引起的DEPs数量相近（海马209个，小脑201个），同样以上调为主。两个脑区仅有51个共同的DEPs，进一步印证了病理变化的区域异质性。对比转录组和蛋白质组数据，发现海马和小脑中分别有44个和98个分子在基因和蛋白水平上同时发生改变，且变化方向高度一致。

3.2.2. 鉴定DIP治疗后Npc1^-/-小鼠脑中的DEPs

DIP对蛋白质组的影响尤为显著，且再次凸显了海马的特异性。DIP在海马中引起了409个DEPs的显著变化，而在小脑中仅引起67个DEPs的变化。更重要的是，DIP在海马中能够逆转60个在NPC1缺陷背景下异常表达的蛋白中的51个，使其表达水平趋于正常。这种逆转效应在小脑中则非常有限（仅逆转8个蛋白）。这表明DIP的治疗效应主要作用于海马的蛋白质网络。

3.3-3.5. 功能富集分析

对DEGs和DEPs分别进行的功能富集分析（KEGG通路分析）揭示，NPC1缺陷导致两个脑区均出现已知的病理通路富集，如“溶酶体”（Lysosome）、“吞噬体”（Phagosome）和“补体系统”（Complement system）等，反映了脂质代谢紊乱和神经炎症。然而，小脑特异性富集了“胞葬作用”（Efferocytosis）和“脂质与动脉粥样硬化”（Lipid and Atherosclerosis）等通路，提示小脑可能存在更活跃的细胞清除过程和脂质代谢异常。

将DEGs和DEPs整合分析后，结果更为清晰。DIP治疗仅在海马中显著富集了多条信号通路，且这些通路的富集主要归因于DEPs的变化，而非DEGs。其中最显著富集的通路是“cGMP-PKG信号通路”。此外，还与“阿尔茨海默病”、“氧化磷酸化”、“帕金森病”等神经退行性疾病相关通路共同富集。特别值得注意的是，有6个线粒体电子传递链（ETC）的蛋白组分（Cox6c, Cox7c, Ndufa1, Ndufa4, Ndufs2, Uqcrq）在DIP治疗后在海马中下调，并且是多个富集通路的共享分子，提示DIP可能通过cGMP-PKG通路影响了海马的线粒体功能。

3.6. 网络分析

蛋白互作网络分析发现，在NPC1缺陷背景下，海马和小脑均出现与神经炎症相关的核心枢纽基因/蛋白，如Ptprc（CD45）、Ccl2（MCP-1）、Tlr2等。但在小脑中，还特异性地出现了Tlr4和Itgam（CD11b）作为核心枢纽，这可能暗示小脑的免疫反应更为强烈或具有不同的特征。DIP治疗后的海马网络中，核心枢纽蛋白包括Alb（白蛋白）、Casp3（Caspase-3）和Icam1（细胞间粘附分子-1）。

3.7. lncRNAs互作网络分析

研究发现NPC1缺陷导致海马和小脑中大量lncRNAs表达异常，并且它们与许多转录因子和蛋白存在潜在的相互作用。例如，小脑中异常表达的lncRNA H19和Rian是重要的网络枢纽。DIP治疗能够上调海马中lncRNA Xist的表达，Xist与参与mRNA剪接和基因转录调控的蛋白存在相互作用，这可能是DIP发挥作用的另一层机制。

3.8-3.9. Western Blotting验证

为了验证组学分析的发现，研究人员进行了Western Blotting实验。首先，他们检测了小胶质细胞吞噬活性的标志物CD68。结果证实，NPC1缺陷小鼠海马和小脑中的CD68蛋白水平均显著高于对照组，且小脑中的CD68表达水平显著高于海马，这为小脑特异性富集的“胞葬作用”通路提供了蛋白质水平的证据，表明小脑小胶质细胞可能处于更强的吞噬激活状态。

随后，他们验证了核心通路中的关键蛋白PKG1（cGMP依赖性蛋白激酶1）。结果非常明确：在海马中，DIP治疗显著上调了Npc1^-/-小鼠的PKG1蛋白表达水平。然而，在小脑中，NPC1缺陷本身导致了PKG1表达的显著下调，而DIP治疗未能逆转这种下调。这一结果完美地印证了蛋白质组学的发现，为DIP特异性激活海马cGMP-PKG通路提供了确凿的实验证据。

研究结论与意义

这项研究通过精妙的多组学整合分析，首次清晰地揭示了双嘧达莫（DIP）在NPC1小鼠模型中发挥区域特异性保护作用的分子蓝图。其核心结论是：DIP的治疗益处，特别是对海马依赖性认知功能的改善，主要是通过抑制磷酸二酯酶（PDE），从而提升cGMP水平，进而激活cGMP-PKG信号通路来实现的，而非此前在成纤维细胞中观察到的腺苷A_2A受体依赖机制。

这种机制的区域特异性（仅在海马有效）与NPC1病理本身存在的脑区差异密切相关。研究表明，NPC1缺陷小脑表现出更严重的神经退行性变和独特的免疫微环境，其特征是小胶质细胞呈现强烈的“超吞噬”状态（由CD68高表达和Efferocytosis通路富集提示），并且基础PKG1表达水平显著降低。这种深层次的病理差异可能使得小脑对DIP通过cGMP-PKG通路发挥作用的干预不敏感。

该研究的深远意义在于：

1. 1.
   阐明新机制：不仅解释了DIP为何能改善NPC1小鼠的海马功能，也解释了其为何对小脑功能无效，为理解药物作用的脑区特异性提供了范例。
2. 2.
   提出新靶点：强烈提示cGMP-PKG信号通路是治疗NPC1海马功能障碍的一个有希望的靶点。
3. 3.
   老药新用：为将已获批的、安全性良好的DIP重新定位用于治疗其他伴有海马和线粒体功能障碍的神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）提供了强有力的理论依据和新的思路。
4. 4.
   揭示新层面：研究还首次系统描绘了NPC1脑中的lncRNA表达谱及其互作网络，为未来研究非编码RNA在NPC1中的作用开辟了新的方向。

总之，这项研究如同一盏探照灯，照亮了DIP治疗NPC1的复杂分子路径，不仅增进了对疾病本身的认识，也为开发新的治疗策略带来了希望。