《ACS Measurement Science Au》：Pyrolyzed Parylene Electrodes for Detection of Tryptophan, Tyrosine, and Gonadotropin-Releasing Hormone
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本文系统评估了热解聚对二甲苯-N微电极（PPNMEs）在检测色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）及促性腺激素释放激素（GnRH）方面的性能。研究表明，与传统的碳纤维微电极（CFMEs）相比，PPNMEs凭借其高比表面积、丰富的边缘位点和更快的电子转移动力学，对上述分析物表现出显著增强的灵敏度（最高提升5倍）和更低的氧化电位。该电极成功应用于小鼠脑组织切片中，实现了外源性及内源性GnRH释放的实时检测，为神经肽及电活性氨基酸的高灵敏、低电位检测提供了新的平台。
引言
神经化学物质，特别是神经肽的灵敏和选择性检测，对于理解大脑信号传导至关重要。碳纤维微电极（CFMEs）因其活性表面积大、导电性优异和生物相容性好，被广泛用于快扫循环伏安法（FSCV）检测生物分子。然而，开发新型电极材料和制造技术对于进一步提高灵敏度和多功能性具有重要意义。聚对二甲苯-N（PPN）作为一种苯环丰富的聚合物，可通过化学气相沉积（CVD）保形沉积在基底上，再经热解形成具有高边缘位点密度和可调表面化学性质的薄碳膜。热解聚对二甲苯-N微电极（PPNMEs）在检测多巴胺方面已显示出优于传统CFMEs的电化学性能，但其在更广泛的神经化学物质（包括氨基酸和神经肽）中的表征尚未见报道。
除了单胺类神经递质，研究人员对色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）等电活性氨基酸以及含有这些残基的神经肽（如促性腺激素释放激素，GnRH）的兴趣日益增长。Trp是多种神经激素的前体，其电化学氧化涉及一个双电子过程。Tyr是儿茶酚胺神经递质（如多巴胺）的生物合成前体，其氧化电位通常在1.13 V和0.39 V左右。GnRH是一种在下丘脑产生的神经肽，通过刺激垂体前叶合成和分泌促黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH），在调节生殖功能中起着关键作用。值得注意的是，GnRH含有电活性氨基酸，特别是Trp和Tyr，这使其能够通过FSCV进行检测和表征。
本研究旨在系统评估Trp、Tyr和GnRH在PPNMEs上的电化学行为，并将其性能与CFMEs进行比较。我们假设PPNMEs能够提供增强的吸附、更高的灵敏度和更低的氧化电位，从而为神经肽和电活性氨基酸的精确测量提供一种高效的工具。
实验方法
化学试剂与材料
色氨酸、酪氨酸和促性腺激素释放激素（GnRH）购自Sigma-Aldrich。储备液（10 mM）用0.1 M HClO4配制，随后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释至工作浓度（1 μM）。
PPNMEs的制备
将直径50 μm的铌丝在4 M NaOH中电化学蚀刻至尖端直径1 μm。蚀刻后的导线使用化学气相沉积系统涂覆聚对二甲苯-N（PN）。PN包覆的导线在空气中350 °C预热10分钟。碳化过程在快速热处理器（RTP）中进行，先在氩气中600 °C处理10分钟，然后在氩气中950 °C处理10分钟，得到热解聚对二甲苯-N。最终，将导线用玻璃毛细管绝缘，暴露100 μm的电极尖端，并用环氧树脂密封。
CFMEs的制备
将直径7 μm的碳纤维插入硼硅酸盐玻璃毛细管中，使用垂直热拉器拉制形成两个微电极。暴露的纤维长度修剪至50-100 μm。电极在环氧树脂混合物中浸泡30秒以密封玻璃-纤维界面，然后冲洗、干燥并固化。
电化学测量
FSCV使用ChemClamp恒电位仪进行，施加的波形范围为-0.4至1.3 V，扫描速率为400 V/s，频率为10 Hz。使用流动注射分析系统进行测试。由于几何表面积严重低估了多孔碳材料的真实电活性表面积，本研究使用FSCV波形获得的背景充电电流作为有效表面积的替代指标，并将法拉第电流归一化到相应的背景电流，以便在电极类型之间进行准确比较。
脑组织切片中外源性GnRH检测
所有动物程序均经弗吉尼亚大学动物护理与使用委员会批准。制备含有尾壳核的冠状脑切片（400 μm厚）。将PPNMEs插入组织约75 μm深处，平衡10-15分钟。将GnRH加载到电极附近的玻璃毛细管中，使用纳升注射器进行局部喷射，并记录循环伏安图。
脑组织切片中内源性GnRH释放检测
实验经弗吉尼亚大学动物护理与使用委员会批准。使用8-10周龄的野生型C57BL/6雄性小鼠。制备含有正中隆起（ME）的旁矢状切片（300 μm厚）。将PPNMEs插入ME中50-75 μm深处，平衡15分钟后记录数据，以监测自发的内源性GnRH释放。
结果
表面表征
首先，通过扫描电子显微镜（SEM）观察了PPNME和CFME的表面形貌。CFME表面相对光滑，可见一些沟槽，碳纤维直径约为7 μm。相比之下，PPNMEs形成于蚀刻的铌丝上，整体直径约为1 μm，显著小于CFs。此外，PPNMEs中的纳米孔比CFMEs表面的沟槽更大、更深，这种结构能够产生捕获效应，从而提高灵敏度。表面化学分析表明，PPNMEs具有略高的含氧官能团（C-O和C=O），这有助于促进肽的吸附。
色氨酸的电化学检测
在CFME上，Trp产生两个氧化峰：主峰在1.08 V，次峰在0.45 V。而在PPNMEs上，Trp表现出三个氧化峰：0.96 V、0.4 V和0.75 V。PPNMEs的氧化电位更低，峰电流显著更高，表明其促进了更快的电子转移，对Trp检测具有更高的灵敏度。校准曲线显示，PPNMEs的灵敏度（13.2 ± 0.8 nA/μM）是CFMEs（4.4 ± 0.4 nA/μM）的三倍以上。即使经过背景电流归一化处理后，PPNMEs对Trp的信号仍显著高于CFMEs，证实其优越的灵敏度不仅源于表面积的增加，还归因于更活跃的表面。扫描速率分析表明，CFMEs的检测过程更受扩散控制，而PPNMEs则表现出更受吸附控制的特征，这可能是由于Trp被捕获在裂缝中，产生了薄层扩散效应，从而预富集了Trp。
酪氨酸的电化学检测
在CFME上，Tyr产生两个氧化峰：主峰在1.02 V，次峰在0.30 V。在PPNMEs上，Tyr的主氧化峰略微移至更低的电位（0.89 V），峰电流显著增加。校准曲线显示，PPNMEs的灵敏度（5.4 ± 0.7 nA/μM）几乎是CFMEs（1.1 ± 0.1 nA/μM）的五倍。归一化电流比较再次证实，PPNMEs的增强灵敏度并非仅由表面积增加引起。扫描速率分析表明，CFMEs的检测过程受扩散控制，而PPNMEs则表现出更受吸附控制的特征，这归因于捕获效应和表面官能团增强了吸附。
氧化机制
Trp的初始氧化涉及2个电子和质子的损失，随后发生水合，在吲哚环上形成羰基，产生初级氧化产物。进一步氧化和重排产生次级和三级产物。Tyr的氧化涉及酚侧链电子的损失，形成酪氨酰自由基，随后水合产生次级产物。PPNMEs显示出增强的次级和三级峰，这是由于中间体被捕获在表面附近，导致这些产物的电流更高。如果电极表面粗糙或有裂缝，氧化中间体和产物会在表面附近保留更长时间，更有可能发生进一步氧化。PPNMEs比CFMEs具有更多的裂缝和含氧官能团，这增加了检测次级和三级氧化产物的可能性。
促性腺激素释放激素（GnRH）的电化学检测
在CFME上，GnRH产生两个氧化峰：主峰在1.05 V，次峰在0.45 V。在PPNMEs上，主氧化峰出现在更低的电位（0.96 V），峰电流更高。校准曲线显示，PPNMEs的灵敏度（6.8 ± 0.3 nA/μM）是CFMEs（2.5 ± 0.3 nA/μM）的2.7倍。归一化电流比较和扫描速率分析均证实，PPNMEs对GnRH的检测具有更高的灵敏度和更受吸附控制的特征。将Trp、Tyr和GnRH的CV图叠加比较发现，GnRH的伏安响应与Trp非常相似，表明GnRH的氧化主要由其Trp残基主导。PPNMEs在所有分析物中均表现出良好的重现性。
脑组织中GnRH的检测
PPNMEs被用于检测小鼠脑切片中的GnRH。首先，将电极插入切片75 μm深处，使用纳升注射器局部喷射100 μM GnRH。背景扣除后的CV显示在1.20 V处出现一个肽氧化峰。该氧化峰在脑切片中出现的电位略高于体外测量值，这可能是由于电极在组织内运行时电子转移动力学降低所致。此外，在流体施加过程中观察到约0.1和0.12 V处的干扰峰，这源于电极表面双电层充电的变化，而非肽氧化。为了进一步评估生物适用性，PPNMEs被用于记录含有正中隆起（ME）的切片中自发的内源性GnRH释放。在5分钟的记录中，观察到自发的GnRH瞬变，在1.20 V处产生一个浓度为0.65 μM的峰，并伴有与喷射实验中相同的干扰峰。喷射和自发组织信号之间的相似性有力地支持了1.2 V峰反映了生物条件下GnRH检测的结论。
结论
本研究证明，与CFMEs相比，PPNMEs在检测色氨酸、酪氨酸和GnRH方面具有显著更高的灵敏度，电流响应最高可提高5倍，且氧化电位更低。SEM成像显示，PPNMEs具有高度多孔的纳米结构表面，这促进了吸附控制的电化学过程，并有助于改善分析物的预富集。在PPNMEs上检测到多个氧化峰，这与芳香族氨基酸的已知氧化途径一致，并归因于裂缝增加和表面粗糙度引起的捕获效应。PPNMEs有效检测了含有Trp和Tyr的神经肽GnRH，并表现出增强的电流响应，证明这些电极可用于监测神经环境中更复杂的生物分子。最后，使用PPNMEs在小鼠脑组织中检测GnRH，突显了该平台的现实适用性。PPNMEs为电极设计提供了一种新方法，并扩展了其在监测复杂生物系统中各种神经活性肽和小分子的应用。
