基于单分子定位显微技术的衍射极限下折射率映射研究

《ACS Nano》：Refractive Index Mapping below the Diffraction Limit via Single Molecule Localization Microscopy

本研究报告了一种将单分子定位显微镜（SMLM）与原子力显微镜（AFM）相结合的新方法，实现了对生物样品（如胶原纤维）折射率（n）的亚衍射极限分辨率映射，精度可达σn< 3 × 10–3。该方法通过AFM提供荧光团轴向位置（HAFM）的基准真值，将SMLM中点扩散函数（psf）形状对样品折射率的依赖这一不适定问题转化为适定问题，揭示了单根胶原纤维在干燥和再水化过程中折射率与溶胀行为的异质性及其在亚500纳米尺度上的波动，为研究生物大分子的纳米级结构特性提供了强大工具。

　　

引言

单分子定位显微镜（SMLM）是一种强大的三维成像技术，其分辨率超越了传统光学显微镜的衍射极限。除了精确定位荧光发射体外，单分子点扩散函数（psf）的形状还蕴含着额外的信息，例如发射体与玻璃盖玻片之间样品的折射特性。然而，样品折射率（n）的变化对psf形状的影响与荧光团离焦距离的影响相似，这使得单独从psf分析中精确确定折射率成为一个不适定问题。本研究提出了一种双模态成像策略，通过结合SMLM与原子力显微镜（AFM），利用AFM独立测量样品厚度（H_AFM）作为基准真值，将折射率确定问题转化为适定问题，从而实现了对生物样品折射率的亚衍射极限分辨率映射。

结果

方法原理与理论精度

该方法的原理如图1a所示。荧光标记的样品（折射率为n_s）置于玻璃盖玻片（折射率为n_g）上，并分别进行AFM和SMLM成像。AFM提供了荧光团到盖玻片表面的真实距离H_AFM。SMLM成像则在相同的样品上进行，其psf形状同时依赖于荧光团的轴向位置和样品折射率（图1b, c）。通过比较SMLM基于不同假设折射率计算出的表观高度H_SMLM(n_s)与AFM测得的真实高度H_AFM，可以反推出样品的实际折射率n_s。

研究首先通过克拉美-罗下界（CRLB）分析了该方法测定折射率的理论精度Δn_s。分析表明，Δn_s随着样品厚度H的增加而减小，并且与信背比（SBR）和收集到的总信号光子数N的平方根成反比（图1d）。在典型的实验条件下（例如N = 10⁵光子，SBR = 100，H = 100 nm），理论预测的折射率测定精度可优于10^-3量级。

单根胶原纤维折射率的测定

作为原理验证，研究选取从小鼠尾腱中分离的单个胶原纤维作为模型系统。胶原纤维被稀疏地固定在盖玻片上，并通过AF647标记的I型胶原抗体进行荧光标记。SMLM成像在约500 nm的离焦量下进行，以获得最佳的定位精度。通过合并同一荧光分子的多次闪烁定位，获得了约5 nm的轴向单分子定位精度。

对于一根典型的胶原纤维，通过改变psf模型中的假设折射率n_s，得到了一系列对应的H_SMLM(n_s)值。将H_SMLM(n_s)与AFM测得的该纤维高度H_AFM= 138 nm进行比较，并通过线性拟合找到交点，确定该胶原纤维的折射率为n_collagen= 1.437 ± 0.003（图S2c）。该值与已报道的水合胶原薄膜的折射率相符。实验测得的误差（σ_n= 0.0029）与基于CRLB的理论预测值（Δn_s= 0.0034）高度一致。

胶原纤维溶胀与折射率的关系

胶原纤维在水合时会发生溶胀，其横截面积可比干燥状态增加高达4倍。水合过程中，大量的自由水进入胶原分子间的空间，导致分子间距增加，从而降低胶原的有效折射率，使其趋近于水的折射率（n_water= 1.33）。

研究比较了不同纤维在干燥和水合状态下的横截面积变化（ΔA）及其对应的水合状态折射率。结果显示出显著的纤维间异质性：折射率n_collagen在1.38至1.48之间变化，而溶胀度ΔA则在150%至350%之间（图2a）。更重要的是，折射率与溶胀度之间存在强烈的负相关关系：溶胀度越高的纤维，其水合状态的折射率越低。然而，数据点围绕简单混合模型（n_collagen= (n_dry+ ΔA·n_water)/(1 + ΔA)）预测曲线的分散程度超出了方法的测量误差范围，表明溶胀度并非决定折射率的唯一因素。

研究者将这种偏差归因于胶原样品在干燥过程中达到的脱水程度存在差异，这可能源于不同纤维间胶原分子交联度的不同。交联度较低的纤维可能（i）在再水化时溶胀更明显（ΔA更大），并且（ii）在干燥状态下残留的水合程度更高，导致其干燥状态的折射率n_dry较低。根据上述模型反推得到的单根纤维的n_dry值分布很广，大约在1.45到1.75之间（图2b）。

单根胶原纤维轴向折射率映射

研究进一步考察了折射率沿单根胶原纤维轴向的变化。通过使用一个包含100个单分子定位的滑动窗口（对应约250 nm的空间分辨率），绘制了沿纤维中心轴的折射率分布图（图3b）。结果显示，折射率在1.35至1.60之间存在显著波动，表明沿纤维长度方向存在不同程度水化的区域。

为了研究折射率波动的特征长度尺度，分析了不同大小滑动窗口下折射率的方差σ_n²。总方差由实验噪声方差σ_n,exp²和胶原纤维本身的折射率波动方差σ_n,collagen²组成。通过扣除实验噪声贡献，得到了胶原纤维本身折射率波动随窗口大小（即沿纤维的距离）的变化（图3c）。有趣的是，方差在距离小于500 nm时呈现较大值，而在更大距离上则迅速减小。考虑到单个胶原分子的长度约为300 nm，这一结果表明胶原纤维内部在水合状态上存在显著的空间异质性，其尺度与单个胶原分子的尺度相当。

讨论

方法局限性

该方法精度的主要限制在于高度测量的准确性。当前使用STORM技术获得的轴向定位精度约为5 nm。采用DNA-PAINT等技术，通过合并大量定位事件，有望获得更高的定位精度。荧光标记的大小、染料分子的取向自由度（因为方位角和倾斜角也会影响psf形状）、成像系统的残余像差等因素都需要仔细控制。对于更薄的样品（如低于40 nm），若要达到Δn_s= 10^–2的精度，则需要AFM提供优于1 nm的高度测量精度，并收集足够多的信号光子（图S4）。此外，当前方法仅对染料标签与玻璃表面之间的平均折射率敏感，潜在的轴向不均匀性会被平均掉。

与其他方法的比较

与其他测定生物样品折射率的技术相比，如光学相干断层扫描（OCT）和椭偏仪，其空间分辨率通常受限在衍射极限水平，难以表征100 nm以下的样品。散射干涉（iSCAT）技术虽能达到纳米分辨率，但其对比度同时依赖于折射率和颗粒尺寸，也需要独立的尺寸测量。本研究提出的SMLM-AFM联用技术则在提供纳米级空间分辨率的同时，实现了对折射率的定量测量。

对胶原特性的启示

本研究在单根胶原纤维水平获得的水合状态折射率与文献中基于胶原薄膜或纤维束的报道值基本吻合。然而，高分辨率成像揭示了传统 ensemble 测量无法发现的纤维间和纤维内的异质性。折射率与溶胀行为的关联以及沿纤维轴向的波动，很可能与胶原分子间交联度的局部差异有关。胶原分子在翻译后修饰（如赖氨酸羟化）程度上的变异，会影响其形成共价交联的能力，从而可能导致在单个胶原分子长度尺度（约300 nm）上出现水合程度和折射率的波动。对绿色荧光蛋白等的研究也观察到其折射率在脱水过程中从1.45增加到1.75，与本研究中推断的胶原干燥状态折射率范围相符。

结论

本研究报道了一种结合超分辨荧光显微镜（SMLM）和非光学高分辨率成像技术（AFM）的折射率映射方法，其空间分辨率突破了光学显微镜的衍射极限。该方法通过利用点扩散函数形状对样品折射率的依赖性，并结合AFM提供的独立厚度信息，实现了对样品折射率的高精度、纳米级测量。该方法具有普适性，可在许多已配备SMLM和AFM的实验室中推广应用。将其应用于胶原纤维研究，揭示了在溶胀过程中意想不到的纤维间差异性，以及单根纤维在亚500纳米尺度上的折射率波动，这些发现可能与胶原分子间交联量的变异密切相关，为在纳米尺度上理解生物大分子的结构和物理性质提供了新的视角。

方法与实验

材料

实验使用了PBS、AF647标记的抗I型胶原抗体、BSA、多聚甲醛（PFA）、葡萄糖、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、半胱胺等试剂。盖玻片、牙科胶、荧光微球等耗材。胶原样本取自6月龄雌性野生型小鼠的尾部。

胶原样本制备

从小鼠尾部提取肌腱，在立体显微镜下仔细分离出胶原纤维和原纤维，并将其转移到等离子清洗过的盖玻片上。用去离子水冲洗样品以去除多余物质和盐分，然后用氮气吹干并保存。

抗体标记

在盖玻片上安装定制液槽后，用稀释于含1% BSA的PBS中的AF647标记抗体对胶原原纤维进行标记（室温1小时）。标记后移除染色液，用去离子水清洗，并用4% PFA固定15分钟。固定后再次清洗，并在成像前用PBS保持水合。

单分子定位显微镜（SMLM）成像

使用自建的全内反射荧光（TIRF）显微镜系统，配备100倍/1.46 NA物镜和EMCCD相机。采用640 nm激光进行旋转TIRF照明。添加荧光微球作为定位标记。dSTORM成像在含有葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶光保护体系和半胱胺的 blinking 缓冲液中进行。样品被故意离焦约500 nm进行成像，每个区域记录至少80,000帧图像。通过测量荧光微球的z栈来确定系统的像差。

原子力显微镜（AFM）成像

SMLM成像后，样品经清洗、干燥后转移到AFM系统。利用参考标记精确定位相同的区域。样品先在干燥条件下用AC模式成像，然后用PBS再水化后在Qi模式下成像。使用不同的探针分别用于空气和液体成像。

数据分析

SMLM数据使用考虑了系统像差和样品光学属性的psf模型进行单分子定位。通过盖玻片上非特异性结合的抗体分子确定参考平面（z = 0）。胶原纤维的轴向位置通过滑动窗口分析其横截面轮廓的高度来确定，该高度依赖于psf模型中假设的折射率n_s。将不同n_s假设下得到的H_SMLM与AFM测得的H_AFM进行拟合，其交点即为胶原纤维的折射率。通过重采样方法估计高度测量和折射率计算的误差。单分子定位精度通过追踪同一荧光分子的多次闪烁定位来计算标准误差。