《Environmental Science & Technology》：Monitoring Legionella in Drinking Water: Should We Focus on L. pneumophila or All Species to Effectively Protect Public Health?
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本综述系统评估了饮用水系统中军团菌监测策略的公共卫生效益，指出针对嗜肺军团菌（L. pneumophila）的靶向监测比全菌种监测更具成本效益和健康相关性。文章通过临床病例归因、环境分布数据和生态学差异分析，论证了非嗜肺军团菌（L. non-pneumophila）作为指示菌的局限性，为基于风险的监测政策（如QMRA）提供了科学依据，支持在常规及高风险场景下优化资源分配。
引言
自1976年美国费城军团菌病首次爆发以来，人们对军团菌的生物学特性、传播途径和风险管理策略取得了显著进展。然而，预防和控制措施仍存在关键空白，全球军团菌病发病率持续上升。军团菌病是一种急性肺炎样疾病，其致病菌为军团菌属（Legionella）的革兰氏阴性细菌。目前已知的60多种军团菌中约有30种具有致病性，其中嗜肺军团菌（L. pneumophila）是导致全球大多数军团菌病病例的主要菌种。环境监测通常采用基于培养的方法（如ISO 11731），使用添加了抗菌剂的缓冲炭酵母提取物（BCYE）琼脂培养基。这些选择性培养基最初是为选择性培养嗜肺军团菌而设计的，但也支持各种非嗜肺军团菌的生长。一个关键的考虑是，环境监测应侧重于主要与军团菌病相关的嗜肺军团菌，还是更广泛的军团菌菌种类别。本综述旨在评估可培养的嗜肺军团菌或所有可培养的军团菌菌种的结果，哪个对建筑饮用水系统的健康风险评估更有效。
与非嗜肺军团菌物种相关的风险是什么？
军团菌病在检测有限的地区可能诊断不足。广泛依赖尿抗原检测进一步导致诊断不足，因为该检测主要检测嗜肺军团菌血清1群，限制了由其他嗜肺军团菌血清群或非嗜肺军团菌菌种引起的感染的识别。培养或基于PCR的呼吸道样本检测结果显示，嗜肺军团菌占全球大多数培养确认病例，其中血清1群在丹麦、欧盟/欧洲经济区、日本和荷兰占主导地位。在澳大利亚和新西兰，长滩军团菌（L. longbeachae）是地方性流行，可能与盆栽土壤和堆肥接触有关。在其他西方国家，长滩军团菌占报告感染的比例要小得多。归因于其他非嗜肺军团菌菌种的培养确认病例在日本、美国和大欧洲经济区的大多数国家中占比不到4%。这些低百分比可能是由于非嗜肺军团菌菌种的毒力较低，通常只在严重免疫缺陷患者中引起疾病。
定量微生物风险评估（QMRA）可以通过基于暴露估计和剂量反应关系提供健康风险的定量估计来补充流行病学监测。剂量反应模型显示了量化对于比例风险管理至关重要。浓度数据应与菌种特性一起解释；将针对嗜肺军团菌建立的行动水平外推到其他军团菌菌种缺乏科学依据。为了避免错误描述风险，监测应旨在确定是否存在特定的致病菌种，以及其浓度是否可能超过从已发表的剂量反应模型和健康基准（如10–4年感染风险或10–6DALY）推导出的浓度阈值。
非嗜肺军团菌物种在环境中有多常见？
欧洲的研究表明，非嗜肺军团菌菌种经常从建筑饮用水系统中分离出来，要么单独存在，要么与其他军团菌菌种共存。在德国的家庭热水系统中，嗜肺军团菌占分离株的83.8%。研究发现，降低的热水温度与长柄军团菌（L. anisa）的流行率增加有关。在意大利一家医院的冷水样本中，长柄军团菌的流行率从热水样本中的5.1%增加到44.5%。在西班牙，冷水系统中非嗜肺军团菌菌种的流行率也较高。然而，热水系统并不总是以嗜肺军团菌为主。在医院热水系统中，非嗜肺军团菌分离株的比例很高（>75%），以都灵军团菌（L. taurinensis）为主。这些发现表明温度在水系统中军团菌菌种生态学中的作用。长柄军团菌的高流行率在多个国家都有报道。嗜肺军团菌与其他军团菌菌种的共同分离也很显著，在一些研究中超过30%的阳性样本中发生。
尽管非嗜肺军团菌菌种在饮用水系统中广泛存在，但它们对军团菌病病例的贡献很低。例如，长柄军团菌虽然在冷水系统中很常见，但在2019年至2021年间在欧洲仅涉及4例军团菌病病例，在2018年至2019年间在美国仅涉及3例军团菌病病例。这种差异与早期研究一致，表明长柄军团菌在环境中比在临床样本中更普遍。这种差异可能是由于长柄军团菌的低毒力，使得只有严重免疫缺陷的人易感疾病。在苏格兰、新西兰和瑞典，通过对痰样本进行PCR诊断来常规监测病例，但这并没有导致发现更多与长柄军团菌相关的病例。这表明目前由于使用的诊断方法，并没有对长柄军团菌病例漏报。荷兰的一项研究调查了来源中军团菌菌种的存在，以将环境菌株与军团菌病患者的菌株联系起来。结果显示，即使与非嗜肺军团菌菌种相关的来源经常被检测到；大多数患者感染的是嗜肺军团菌。在荷兰，未能建立非嗜肺军团菌病例与饮用水环境之间的联系。
可培养的非嗜肺军团菌物种能否作为嗜肺军团菌的可靠“指示生物”？
有研究声称非嗜肺军团菌，如长柄军团菌，可能是嗜肺军团菌的指示菌。然而，与他们结论相反的是，这两项研究显示的数据表明长柄军团菌是嗜肺军团菌的不良指示菌。一项研究观察到，当对医院建筑管道系统应用70°C的热处理时，长柄军团菌被根除，而嗜肺军团菌仍然可以被观察到。这表明两种军团菌对热处理的反应不同，这可能导致当长柄军团菌被用作嗜肺军团菌的指示菌时出现假阴性结果。另一项研究观察到，在COVID-19大流行期间长时间的停滞导致长柄军团菌阳性样本减少和嗜肺军团菌样本增加。这些结果也证明两种军团菌对建筑管道系统中的条件表现不同。
为了检验可培养的非嗜肺军团菌菌种（不包括嗜肺军团菌，因此不是全部可培养的军团菌）是否可以作为可培养的嗜肺军团菌的可靠指示剂，我们评估了可培养的非嗜肺军团菌是否符合指示生物的一般标准。指示生物的理想特征可分为两类：生物体本身的生物学属性和用于检测它的方法的属性。本节评估可培养的非嗜肺军团菌菌种是否满足作为嗜肺军团菌可靠指示剂的生物学和方法学标准，即：(i) 指示生物的数量必须高于目标生物；(ii) 指示生物的生态学必须与病原体密切一致；(iii) 指示生物必须比病原体更耐消毒；(iv) 指示生物在人工培养基上接种时必须能独立于其他生物生长。
关于第一个标准，大多数研究表明嗜肺军团菌经常被培养出来，而非嗜肺军团菌菌种被检测到的频率较低。非嗜肺军团菌可能由于其浓度相对于嗜肺军团菌较低而未被检测到。因此，可培养的非嗜肺军团菌菌种不满足这第一个标准。
关于第二个标准，生态学比较主要集中在长柄军团菌和嗜肺军团菌上。实验室研究表明，长柄军团菌也在原生动物体内复制。温度在决定饮用水系统中军团菌菌种的生长和分布方面起着关键作用。一项中试研究表明长柄军团菌和嗜肺军团菌有不同的温度偏好，长柄军团菌在较低水温下繁殖更有效，而嗜肺军团菌在较高温度下繁殖更有效。现场研究也表明饮用水温度对非嗜肺军团菌和嗜肺军团菌的生长有不同的影响：在较低温度（冷水样本）下，非嗜肺军团菌菌种更常被检测到，而在较高温度（热水样本）下，嗜肺军团菌最常被检测到。因此，“所有军团菌菌种”并不是嗜肺军团菌的可靠指示剂。
关于第三个标准，目前证据表明，在某些消毒方案下，非嗜肺军团菌菌种和嗜肺军团菌可能具有不同的消毒敏感性。因此，这些发现表明所有军团菌菌种的量化部分满足作为嗜肺军团菌灭活指示剂的这一标准。
关于第四个标准，几种非嗜肺军团菌菌种在BCYE琼脂上仅显示边际生长。对于长柄军团菌等菌种，最佳回收发生在pH 6.5，低于ISO推荐的pH 6.9 ± 0.1。然而，使用ISO 11731:2017方法可以经常在饮用水样本中观察到长柄军团菌，表明ISO推荐的pH值并不会完全抑制这两种军团菌的生长。因此，可培养的非嗜肺军团菌菌种在人工培养基上并不能持续独立生长。
总体评估，我们得出结论，可培养的非嗜肺军团菌菌种不适合作为可培养的嗜肺军团菌的指示剂，因为它们(i) 并非持续更丰富，(ii) 占据不同的生态（如温度）位点，(iii) 消毒敏感性不同，以及(iv) 在标准培养基上的回收率不一致。
针对致病性军团菌物种的靶向监测替代方法
常规平板培养（ISO 11731）仍然是大多数法规中的标准方法，但其10至15天的周转时间可能会延迟军团菌生长事件的检测和纠正措施的实施。更快、针对菌种的方法可以解决这一差距，并支持为致病性军团菌菌种选择最相关的监测目标。
定量PCR（qPCR）检测所有军团菌菌种或选定菌种（包括嗜肺军团菌）的基因组拷贝。与基于培养的方法一样，比较研究表明，嗜肺军团菌可以在非嗜肺军团菌菌种不存在的情况下存在，反之亦然。qPCR的短周转时间（数小时）可以实现早期筛查和优先干预系统区域。在高风险环境（如医院）中，同时运行嗜肺军团菌特异性检测和针对高风险非嗜肺军团菌菌种的检测可能是必要的，以保护易受毒力较低的非嗜肺军团菌病原体感染的免疫缺陷患者。一个关键限制是标准qPCR量化的是基因组拷贝而不是菌落形成单位（CFU），捕获了完整、受损、可存活但不可培养（VBNC）和死亡细胞的DNA。活力PCR和基于RNA的检测方法可以帮助缩小基因组拷贝和CFU之间的差异，但需要进一步标准化以用于监管，并可能引入额外的成本、工作流程复杂性和方法学偏差。尽管存在这些挑战，qPCR，特别是当具有菌种特异性时，可以支持更快、更有针对性的干预。
除了分子工具，替代的基于生长的方法提供了实际优势。基于酶底物的最可能数（MPN）培养方法和Diamidex MICA检测能够在2-7天内单独量化存活的嗜肺军团菌，而不依赖传统的平板培养。虽然这些方法与传统培养不同，但它们以CFU或MPN表示结果，使其易于在现有的风险评估框架内解释。
使用选择性检测和量化致病性军团菌菌种的方法可以将控制工作集中在造成最大疾病负担的菌种上。需要进一步研究来确定何时以及如何将高风险的非嗜肺军团菌菌种纳入监测策略。
军团菌与其他水相关机会致病菌相关的疾病负担
除军团菌外，其他机会致病菌也可能存在于饮用水系统中。这些包括某些非结核分枝杆菌（NTM）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、棘阿米巴属（Acanthamoeba spp.）、福氏耐格里虫（Naegleria fowleri）和软骨瓦德菌（Waddlia chondrophila）。虽然传播途径不同，但饮用水被认为是许多这些微生物的重要暴露途径。
一项结构化的专家判断研究估计，52%的军团菌病例、67%的NTM病例和16%的假单胞菌败血症病例可归因于饮用水。使用这些估计，计算得出美国每年约有5,760例军团菌病病例、46,400例NTM感染病例和929例假单胞菌败血症病例，分别导致520、2,560和112例死亡。类似地，在加拿大安大略省，NTM和假单胞菌菌种与比军团菌更高的住院率和死亡率相关。
荷兰监测数据显示，93.5%的培养确认病例由嗜肺军团菌引起，仅6.5%由非嗜肺军团菌引起。这相当于每10万人中平均年发病率分别为6.3和0.4例住院病例。相比之下，致病性NTM和烟曲霉的估计范围在每10万人4.1至7.2例。在2.2%的社区获得性肺炎住院病例中检测到的铜绿假单胞菌，相当于估计每10万人30.8例病例，显著高于任何军团菌菌种。这些比较表明，非嗜肺军团菌菌种对总体疾病负担的贡献远小于其他水传播机会致病菌。因此，将监测和控制工作集中在嗜肺军团菌和其他高负担机会致病菌上，对于保护公共卫生可能更有效和资源效率更高。
启示
基于我们的综述结果，我们得出结论，可培养的嗜肺军团菌是比量化所有可培养军团菌菌种更有效的目标，以减轻与建筑饮用水系统相关的军团菌病病例，原因如下：
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全球监测显示，嗜肺军团菌引起绝大多数水传播的军团菌病病例。
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尽管非嗜肺军团菌菌种在饮用水系统中广泛存在，但它们很少引起疾病。因此，一刀切的法规（例如，“所有军团菌菌种”监测）不会产生比针对嗜肺军团菌的法规更大的公共卫生效益。此类法规可能导致后续控制措施的成本远高于仅关注嗜肺军团菌。
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长柄军团菌和嗜肺军团菌之间的生态学差异，特别是在生长温度方面，使得“所有军团菌菌种”成为饮用水系统中嗜肺军团菌的不可靠指示剂。
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在高风险环境（如医疗机构）中，监测嗜肺军团菌和高风险非嗜肺军团菌菌种可能是必要的，以保护易受毒力较低的非嗜肺军团菌病原体感染的免疫缺陷患者。在这些情况下，用于风险评估的目标机会致病菌的选择可以基于保守方法或由疾病负担研究指导。
