基于感官蛋白质组学方法解析马铃薯蛋白水解物中的分子苦味密码及其减苦策略研究

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Deciphering the Molecular Bittercode in Potato Protein Hydrolysates through a Sensoproteomics Approach

本综述系统阐述了采用感官蛋白质组学（Sensoproteomics）策略解码马铃薯（Solanum tuberosum L.）蛋白水解物（PPH）中强烈苦味异味的分子基础。研究通过活性引导分级分离结合非靶向/靶向蛋白质组学（UHPLC-ToF-MS/MS），首次鉴定出21种新型苦味肽，其苦味识别阈值（Bitter Recognition Thresholds）介于48–707 μmol/L，揭示了其作为关键苦味贡献者的作用。同时，量化了文献已知苦味物质（如氨基酸、脂肪酸及其氧化产物）并通过重构实验评估其影响，为低苦味PPH的定向生产提供了新见解（如开发UHPLC-MS/MS监测方法），对提升植物基蛋白（Plant-based Proteins）的感官品质与消费者接受度具有重要意义。

　　

引言

随着全球人口预计到2050年将达到90亿，对蛋白质的需求日益增长。动物源蛋白在农业和环境层面难以满足这一需求，因此植物基蛋白，尤其是来自新来源和副产品的蛋白质，如马铃薯蛋白，变得尤为重要。在马铃薯淀粉生产过程中，每吨马铃薯约产生7立方米马铃薯汁，其中干物质含有20–25%的蛋白质。马铃薯蛋白主要通过热沉淀溶解蛋白制得。德国过去15年的平均马铃薯淀粉年产量为35万吨，凸显了该蛋白源的巨大潜力。

马铃薯蛋白主要由蛋白酶抑制剂（50%）、马铃薯球蛋白（Patatin，高达40%）和其他高分子量蛋白（10%）组成。其必需氨基酸含量在植物蛋白中最高，与鸡蛋或酪蛋白相当。此外，马铃薯蛋白被认为无过敏原，是豆类蛋白（如大豆或豌豆）的有用替代品，并具有良好的功能特性，如泡沫和乳液稳定性、凝胶形成和抗氧化活性。然而，马铃薯蛋白，尤其是热凝固蛋白，具有令人不快的砂质质地，且在水中的溶解度差（约25–30%溶解），限制了其应用范围。

为了缓解这些问题，可采用酶法或酸法水解生产更有利且多功能的蛋白。水解后，高达80%的马铃薯蛋白溶解，扩大了应用范围。此外，泡沫能力和稳定性可提高多达20倍，持油能力可提高5倍。马铃薯蛋白水解物甚至比蛋白本身具有更高的抗氧化活性，可用于抑制脂肪酸的自氧化。水解过程中，抗营养的蛋白酶抑制剂（如占总量34%的马铃薯抑制剂II（PI-2）和马铃薯半胱氨酸蛋白酶抑制剂（PCPI）家族）被消化成肽并失去抑制功能，从而提高了营养价值。蛋白质水解的缺点是释放苦味肽，限制了蛋白水解物的消费者接受度。对不同产品（如酪蛋白水解物、乳清蛋白水解物、奶油干酪）以及植物基蛋白水解物（如鹰嘴豆、大豆、豌豆、油菜籽和小麦）的研究表明，水解产生的苦味肽是苦味异味的原因。然而，针对这些产品或植物基蛋白水解物的具体苦味肽尚未被鉴定。多项研究调查了马铃薯蛋白水解物的功能特性，但尚未有研究涉及其苦味起源。研究揭示了脂肪酸及其氧化产物在马铃薯纤维（淀粉生产的另一副产品）苦味中的重要性，这些化合物也可能存在于水解物中并贡献苦味。

本研究旨在将感官蛋白质组学方法应用于马铃薯蛋白水解物，以识别导致苦味异味的关键苦味肽，从而在未来避免苦味肽的形成。样品经过活性引导分级分离以及非靶向和靶向蛋白质组学技术以阐明苦味肽。此外，量化了文献已知的苦味化合物（如氨基酸、脂肪酸和脂肪酸氧化产物），并进行了重构实验以评估其对整体苦味的影响。

材料与方法

化学品

实验使用的化学品包括乙腈（ACN）、异丙醇、乙醇（EtOH）、甲酸（FA）、多种羟基脂肪酸衍生物、L-氨基酸、碳酸氢铵（NH₄HCO₃）、乙酸铵、氘代水（D₂O）、氘代甲醇（MeOD）、氘氧化钠（NaOD）、脂肪酸及其同位素标记物。超滤、固相萃取（SPE）、高效液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱（UHPLC）用水来自Milli-Q系统。合成的肽段（如VDDDKDFLPF、DDKDFLPF等）购自GenScript和peptides and elephants。食品级氨基酸由Symrise提供。感官分析使用瓶装水（Evian，低矿化度：405 mg/L），pH用甲酸调至5.5。所有化学品纯度均通过定量核磁共振光谱（qNMR）验证。马铃薯蛋白分离物由Avebe提供，一种马铃薯蛋白水解物由Solabia提供，其余购自Sigma和Gerbu。

基本味觉化合物的定量

氨基酸定量：采用改进的稳定同位素稀释分析（SIDA）方法，通过UHPLC-MS/MS（Acquity UPLC BEH Amide柱）定量游离氨基酸。样品分析在三重重复下进行。

脂肪酸及氧化产物定量：采用改进的SIDA方法，使用UHPLC-DMS-MS/MS（Kinetex C18柱）定量脂肪酸和脂肪酸氧化产物。所有样品均进行三重重复定量。

超滤

使用分子量截留（MWCO）为5 kDa的膜对苦味最强（KH4）和最弱（KH1）的马铃薯蛋白水解物进行超滤，去除高分子量（HMW）组分，保留低分子量（LMW）组分。LMW和HMW样品冻干保存，用于非靶向蛋白质组学分析。

固相萃取（SPE）

采用C_18ecSPE柱对KH1和KH4的LMW组分进行分离，依次用0.1% FA水溶液（SPE1）、60/40 ACN/0.1% FA水溶液（v/v）（SPE2）和100% ACN（SPE3）洗脱。溶剂去除后样品冻干，用于UHPLC-ToF-MS分析。

制备型高效液相色谱（HPLC）分离KH4_LMW_SPE2组分

将KH4_LMW_SPE2溶解后，在Gemini C18柱上进行半制备分离，采用梯度洗脱，根据UV信号（204 nm）收集26个馏分（F1–F26）。溶剂去除后样品用于味觉稀释分析（TDA）和非靶向蛋白质组学。

感官实验

一般条件与小组培训：14名无味觉障碍史的小组成员经过至少两年培训，熟悉味觉语言和方法。感官分析在22–25°C的感官室进行，使用鼻夹防止交叉模态干扰。样品经两次冻干并通过qNMR确认无溶剂残留。采用啜吸-吐出法进行感官评价。

味觉轮廓分析：将马铃薯蛋白分离物（KPI）悬浮于水中（6 g/100 mL，pH 5.5），由训练小组评估苦、甜、酸、鲜、咸和涩味强度（0-5分）。计算各味觉强度的平均值。

比较味觉轮廓分析：将水解物（KH1–KH4）溶解于水（6 g/100 mL，pH 5.5），与KPI比较评分。超滤馏分和SPE馏分在自然浓度下（pH 5.5）与相应原样比较。

味觉稀释分析（TDA）：将HPLC馏分F1–F25溶解于水（pH 5.5），F26因溶解度差溶于含2%乙醇的水中，进行1:2系列稀释。由小组按浓度递增顺序进行三角测试，确定能区分样品与空白的稀释步骤，即味觉稀释（TD）因子。

人体味觉阈值测定：通过三角测试测定肽的味觉阈值。将1 mmol/L肽溶液（pH 5.5）进行1:2稀释，直至小组无法区分肽溶液与水。个体阈值由首次错过和最后一次正确识别浓度的几何平均值确定，小组平均值作为味觉阈值浓度。

非靶向蛋白质组学

超高效液相色谱-飞行时间-质谱（UHPLC–ToF–MS）：使用TripleToF 6600质谱仪（ESI+模式）和IDA模式获取MS²数据。色谱分离使用Kinetex C8柱，流动相为含1% FA的水（A）和乙腈（B）。进样马铃薯蛋白水解物及其馏分（5 mg/mL），采用梯度洗脱。ToF–MS扫描范围m/z 100–1500。使用MaxQuant软件（v.2.0.2.0; v.2.4.8.0）分析数据，消化模式设为“非特异性”，使用来自UniProt的马铃薯（ID: 4113）FASTA文件。采用Andromeda评分作为筛选标准（评分>100和>50）。

靶向蛋白质组学

超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC–MS/MS）：在5500 QTrap系统（ESI+模式）上验证肽序列。色谱分离使用Kinetex C8柱，流动相为0.1% FA水（A）和0.1% FA乙腈（B），采用梯度洗脱。柱温40°C，进样肽溶液或馏分。

MRM方法开发与肽验证：使用Skyline软件（v24.1.0.199）基于非靶向数据和PROSIT预测模型创建多反应监测（MRM）方法。对于三肽和四肽，考虑a-, b-, c-, x-, y-, z-离子；更长肽段仅考虑b-和y-离子。样品溶解后筛查目标肽的质谱过渡。仅在信号明确且至少有五个（三肽为四个）对齐的质谱过渡时才认为肽得到验证。

定量 ¹H NMR光谱

将合成参比肽溶于D₂O（5–10.0 mmol/L），必要时加入NaOD。使用400 MHz NMR光谱仪（Bruker）通过ERETIC 2工具和PULCON方法进行分析。使用L-酪氨酸（4.08 mmol/L）的特定质子共振信号（7.10 ppm）进行外部校准。数据使用Topspin 3.6.0评估。

结果与讨论

先前研究表明，水解植物蛋白（如大豆、豌豆、油菜籽、鹰嘴豆和花生水解物）的苦味比未水解蛋白增强。然而，近期研究未涉及马铃薯蛋白水解物的味觉，仅发表了关于其功能特性的研究。因此，本研究调查了一种商业马铃薯蛋白分离物（KPI）和四种水解物（KH1–KH4）的味觉轮廓。味觉轮廓分析表明，苦味从分离物（KPI）的1.9显著增加（α < 0.05，ANOVA）至最苦水解物（KH4）的4.3。

这种苦味增加表明蛋白质水解过程中形成了新的苦味化合物。对花生和大豆蛋白水解物的研究表明水解会释放苦味肽。尽管其对植物蛋白的贡献尚未研究，但已知在富含蛋白质的发酵食品（如奶油干酪）中，味觉活性肽是苦味异味的来源。因此，通过应用感官蛋白质组学方法，预计可借助活性引导分级分离结合非靶向和靶向蛋白质组学技术鉴定苦味肽。

此外，研究表明植物蛋白和马铃薯产品中的苦味化合物，特别是某些脂肪酸及其氧化产物，是导致豌豆蛋白和马铃薯纤维苦味的关键因素。而且，水解过程中会形成味觉活性游离氨基酸，可能影响整体味觉轮廓。尽管文献提供了水解蛋白中游离氨基酸的定量数据，但尚未有重构实验评估其对味觉的影响。因此，首先定量了游离氨基酸、脂肪酸和脂肪酸氧化产物以评估其对马铃薯蛋白水解物味觉的影响。

基本味觉化合物的定量

蛋白质水解过程中会产生肽和游离氨基酸。这增加了游离苦味氨基酸的浓度，可能是水解物整体苦味异味的原因。据报道，L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸具有苦味，阈值范围为4至80 mmol/L。为研究游离氨基酸对味觉轮廓的影响，定量了马铃薯蛋白分离物（KPI）以及苦味最强和最弱水解物（KH1, KH4）中的苦味、甜味和鲜味氨基酸。除了苦味氨基酸，鲜味氨基酸尤其值得关注，因为鲜味化合物可以掩盖苦味从而降低整体苦味。定量后，计算剂量超阈值（DoT）因子以估算各氨基酸对不同味觉品质的影响。DoT因子是样品中分析物浓度除以其味觉阈值浓度的比值。如果DoT因子大于1，该化合物很可能贡献样品的味觉；如果在1和0.1之间，可能发生协同效应。

对于KPI，未发现DoT因子超过1的游离氨基酸。在KH1和KH4中，所有苦味氨基酸的DoT因子均大于1。苦味氨基酸L-异亮氨酸（KH1:31.9; KH4:16.4）和L-色氨酸（KH1:7.6; KH4:2.4）在KH1中的DoT因子至少是KH4的两倍，表明这些氨基酸对KH1味觉的影响更显著。鲜味氨基酸L-谷氨酸（KH1:72.5; KH4:19.1）和L-天冬氨酸（KH1:154.9; KH4:29.3）在KH1中的DoT因子也至少是KH4的三倍，这与KH1比KH4具有更强的鲜味相关。此外，甜味氨基酸L-苏氨酸（KH1:4.8; KH4:1.9）、L-丝氨酸（KH1:6.3; KH4:2.7）和L-丙氨酸（KH1:12.4; KH4:4.4）在KH1中也显示出更高的DoT因子。总体而言，KH1的DoT因子高于KH4，表明氨基酸对KH1风味轮廓的影响可能更明显。

除了氨基酸，脂肪酸及其氧化产物已被描述为几种植物蛋白或产品苦味的原因。因此，这些物质在KPI、KH1和KH4中被定量，并使用文献已知阈值浓度计算了DoT因子。总体而言，与分离物相比，水解物中的脂肪酸和氧化产物减少，因为它们要么未检测到，要么浓度低于检测限。在水解物中，只有脂肪酸棕榈酸的DoT > 1（KPI: 57.3; KH1:7.4; KH4:8.2），表明其贡献于水解物的苦味。此外，脂肪酸氧化产物11,12,13-THOA（KPI: 3; KH1:0.6; KH4:1.1）、9,10,11-THOA（KPI: 13.7; KH1:4.4; KH4:1.7）和9,10,13-THOA（KPI: 11; KH1:2.4; KH4:4.0）的DoT因子也大于1。为验证这些文献已知化合物对味觉