《Antioxidants》：Determination of the Antioxidant Capacity of Human Seminal Fluid Using a Fast and Accurate Electrochemical Approach
编辑推荐：
本研究开发了一种基于电化学方法（EDEL）的快速检测技术，用于评估人精浆总抗氧化能力（TAC）。该方法通过测量伪滴定伏安图（PTV）的曲线下面积，在数秒内即可完成检测，且结果与传统的ABTS和DPPH法高度相关。研究证实该方法能有效评估精浆抗氧化能力，并与精子浓度呈正相关，为男性不育的临床诊断提供了快速、准确且易于实施的补充工具。
1. 引言
全球约有10-15%的夫妇受到不孕不育的影响，其中男性因素占30-50%。氧化应激，即活性氧（ROS）产生与抗氧化能力之间的失衡，被认为是导致男性不育的主要原因之一。在生理状态下，ROS在精子获能、顶体反应等过程中发挥重要作用，其水平由精浆中的抗氧化剂维持平衡。然而，当ROS产生超过抗氧化能力时，会导致精子脂质过氧化、蛋白质改变和DNA损伤，从而影响精子质量。
目前，评估生物体液总抗氧化能力（TAC）的常用方法包括2,2-二苯基-1-苦基肼基（DPPH）和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除试验。这些方法虽然应用广泛，但存在耗时长、需要昂贵设备、操作繁琐且缺乏标准化等缺点，限制了其在临床常规实践中的应用。相比之下，电化学方法通过测量抗氧化剂还原氧化剂过程中的电子转移来评估抗氧化能力，具有快速、灵敏、样品需求量少且无需改变样品天然条件等优势。本研究旨在评估一种电化学方法在测定人精浆抗氧化能力方面的适用性。
2. 材料与方法
2.1. 研究人群
研究纳入了2022年3月至2024年8月期间在弗里堡大学医院妇产科寻求生育治疗的30名男性。所有参与者均为正常精子症患者，年龄中位数为39.01岁，禁欲时间中位数为3天。
2.2. 精子质量评估与精浆样本制备
精液样本通过手淫法采集，液化后使用计算机辅助精子分析系统（CASA）评估精子浓度和活力。随后，将精液样本离心，取上清液（精浆）用于新鲜检测或冷冻保存。
2.3. 电化学抗氧化能力测量
使用EDEL电化学生物传感器进行测量。将2 μL样品滴加在丝网印刷碳电极上，在0至1.2 V的电位范围内以100 mV/s的扫描速率记录线性扫描伏安图（LSV），并生成伪滴定伏安图（PTV）。总抗氧化能力以纳瓦（nW）表示，计算为PTV的曲线下面积积分。
2.4. DPPH法测定抗氧化能力
将稀释后的精浆样品与DPPH溶液混合，避光孵育30分钟后，在517 nm波长下测量吸光度。自由基清除活性（RSA%）计算公式为：RSA (%) = [(对照吸光度 - 样品吸光度)/对照吸光度] × 100。
2.5. ABTS法测定抗氧化能力
将稀释后的精浆样品与ABTS•+自由基溶液混合，在734 nm波长下测量吸光度。自由基清除活性（RSA%）的计算方式与DPPH法相同。
3. 结果
3.1. 电化学方法对抗氧化分子能力的评估
研究首先评估了电化学方法对常见抗氧化分子（Trolox、抗坏血酸和尿酸）的检测能力。结果显示，PTV的曲线下面积值与Trolox、抗坏血酸和尿酸的浓度均呈线性关系，表明该方法可用于定量评估溶液的抗氧化能力。
3.2. ABTS和DPPH法对抗氧化分子能力的评估
使用ABTS和DPPH法对相同的抗氧化分子进行检测，结果显示，自由基清除活性（% RSA）与抗氧化分子浓度之间均存在线性关系。相关性分析表明，电化学方法测得的抗氧化能力与ABTS和DPPH法测得的自由基清除活性之间存在强正相关，证实了电化学方法的可靠性。
3.3. 正常精子症患者精浆抗氧化能力的电化学评估
对30名正常精子症患者的精浆样本进行检测，结果显示，精浆的平均抗氧化能力为528.2 ± 142 nW，个体间差异较大（范围：273.0至817 nW）。若以抗坏血酸当量表示，其值为0.736 ± 0.211 mM。相关性分析显示，电化学方法测得的抗氧化能力与精子浓度呈显著正相关（r = 0.5956; p < 0.001），但与总活力、前向运动活力和正常形态率之间未发现显著相关性。
4. 讨论
本研究首次将一种电化学方法应用于人精浆总抗氧化能力的评估。与传统的ABTS和DPPH法相比，该方法具有快速（检测时间<30秒）、样品需求量少（仅需2 μL）、操作简便等优势，更适合临床常规应用。
研究结果证实，该方法能够准确评估精浆的抗氧化能力，且与精子浓度呈正相关，这支持了抗氧化能力作为精子质量评价标志物的观点。精浆中较高的抗氧化能力（与唾液和血液相比）反映了其对精子免受氧化损伤的重要保护作用。然而，本研究也存在一定局限性，如样本量较小且仅纳入了正常精子症患者，未来需要在包含少精子症、弱精子症和畸形精子症患者的大样本队列中进行进一步验证。
5. 结论
综上所述，本研究支持电化学方法在评估人精浆抗氧化能力方面的适用性。该方法作为一种快速、准确的诊断工具，在男性不育的临床诊疗中具有广阔的应用前景，有望为氧化应激相关男性不育的诊断提供新的补充手段。
