靶向TRPC3-Nox2复合物形成缓解骨骼肌萎缩的新机制研究

《Antioxidants》：Inhibition of TRPC3-Nox2 Complex Formation Ameliorates Skeletal Muscle Atrophy

本文揭示TRPC3（瞬时受体电位经典3）与Nox2（NADPH氧化酶2）蛋白复合物形成是驱动骨骼肌萎缩的关键机制。通过基因敲除、药物干预（伊布硒特、Pyr3）及AAV介导的TRPC3 C末端肽表达，证实抑制该复合物可显著改善去神经支配及杜氏肌营养不良症（DMD）模型小鼠的肌肉萎缩、氧化应激（ROS）和肌力下降，为DMD等难治性肌萎缩疾病提供了新的治疗靶点。

　　

3. 结果

3.1. Nox2表达在萎缩骨骼肌中增加

研究首先确认了在杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）模型小鼠（mdx小鼠）的心脏和骨骼肌中，活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）产生均有所增加。通过对人类及小鼠数据库的再分析发现，在胶原VI相关肌营养不良（Collagen VI-related muscular dystrophies, COL6RDs）患者的骨骼肌中，TRPC3（Transient Receptor Potential Canonical 3）和Nox2（NADPH Oxidase 2）的mRNA水平升高。同样，在mdx小鼠的骨骼肌中，Nox2的表达水平也呈现上调趋势。这些结果与先前报道一致，表明Nox2表达的增加与骨骼肌萎缩相关。

3.2. TRPC3缺失减轻去神经诱导的比目鱼肌萎缩

为模拟年龄相关性肌肉萎缩，研究采用了坐骨神经横断模型。在肌肉力量测量（悬挂实验和抓力测试）中，野生型（Wild-Type, WT）小鼠术后肌力下降，而TRPC3基因敲除（TRPC3 Knockout, TRPC3 KO）小鼠则未出现显著变化。在肌肉重量和肌纤维横截面积（Cross-Sectional Area, CSA）方面，WT小鼠的胫骨前肌（Tibialis Anterior, TA）、趾长伸肌（Extensor Digitorum Longus, EDL）、腓肠肌（Gastrocnemius Muscle, GM）和比目鱼肌（Soleus Muscle, SM）均因去神经支配而减少，但TRPC3 KO小鼠的SM重量和CSA未出现萎缩。此外，去神经支配后WT小鼠SM中的ROS产生增加，而TRPC3 KO小鼠则无此变化。通过邻近连接 assay（Proximity Ligation Assay, PLA）检测发现，去神经WT小鼠SM中TRPC3-Nox2蛋白复合物信号显著增强，而TRPC3 KO小鼠中则未检测到该复合物形成。这些结果表明TRPC3-Nox2复合物形成，尤其在SM中，参与了肌肉萎缩过程。

3.3. 伊布硒特抑制TRPC3-NOX2复合物形成并改善肌肉萎缩

研究使用TRPC3-Nox2复合物形成抑制剂伊布硒特（Ibudilast）处理mdx小鼠。伊布硒特处理显著提高了mdx小鼠的悬挂时间，降低了血浆肌酸激酶（Creatine Kinase, CK）水平（肌肉损伤标志物），并抑制了mdx小鼠SM重量的异常增加和CSA的减少。同时，伊布硒特下调了肌肉萎缩标志物MuRF1（Muscle RING-finger protein-1）以及纤维化标志物α-SMA（α-Smooth Muscle Actin）和COL1A1（Collagen Type I Alpha 1 Chain）的mRNA表达。此外，伊布硒特还抑制了mdx小鼠SM中的ROS产生、CD45阳性造血细胞浸润区域的Nox2表达以及TRPC3-Nox2 PLA阳性信号。这些结果证实了抑制TRPC3-Nox2复合物形成可以改善肌肉萎缩。

3.4. TRPC抑制剂Pyr3重现保护作用

为更特异性验证TRPC3-Nox2复合物的作用，研究使用了TRPC3选择性抑制剂Pyr3。Pyr3处理显著改善了mdx小鼠的悬挂时间、最大抓力（Max power），并降低了血浆CK水平。虽然Pyr3对mdx小鼠的SM重量无显著影响，但增加了SM的CSA，并抑制了ROS产生、CD45阳性细胞中Nox2的表达以及TRPC3-Nox2 PLA信号。这些结果与伊布硒特的效果一致，表明特异性抑制TRPC3-Nox2复合物形成可预防肌肉萎缩。

3.5. AAV介导的TRPC3 C末端肽表达局部抑制肌肉萎缩

研究通过腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）在mdx小鼠后肢骨骼肌中过表达TRPC3的C末端肽段（53个氨基酸），该肽段可竞争性抑制TRPC3与Nox2的相互作用而不影响TRPC3的Ca²⁺内流功能。结果显示，该肽段在GM注射部位及TA、EDL、SM中均有表达，但在股四头肌（Quadriceps Muscle, QM）中未检测到。在表达TRPC3 C末端肽的mdx小鼠中，悬挂时间和血浆CK水平未见显著改善，但SM的CSA萎缩得到缓解。这表明局部抑制TRPC3/Nox2相互作用可部分改善肌肉萎缩表型。

4. 讨论

本研究揭示了TRPC3-Nox2复合物形成在骨骼肌萎缩中的关键作用。与其他骨骼肌（如TA、EDL、GM）相比，SM（主要由氧化代谢的I型慢肌纤维组成）对TRPC3-Nox2复合物介导的萎缩更为敏感，可能与缺氧诱导因子HIF-1α上调Nox2表达有关。在mdx小鼠中，浸润的CD45阳性造血细胞也表现出Nox2表达增加，药物干预（伊布硒特、Pyr3）可抑制其表达，提示复合物形成可能同时发生在肌纤维和炎症细胞中。AAV介导的局部基因治疗虽改善了局部肌肉萎缩，但未能系统性改善肌力，可能与表达范围有限有关。TRPC3-Nox2复合物可能通过放大机械牵拉诱导的X-ROS信号（即Nox2产生活性氧，进而激活兰尼碱受体RyR2导致局部Ca²⁺浓度升高）通路，导致肌细胞功能紊乱。鉴于多种肌萎缩疾病存在共同的变性坏死过程，靶向TRPC3-Nox2蛋白-蛋白相互作用有望成为治疗杜氏肌营养不良症（DMD）、肌少症（Sarcopenia）等难治性肌萎缩疾病的广谱新策略。

5. 结论

TRPC3-Nox2复合物形成是氧化应激介导的骨骼肌萎缩的关键驱动因素。通过基因敲除、药物抑制（伊布硒特、Pyr3）或肽段竞争性抑制该复合物，均可有效缓解去神经和DMD模型小鼠的肌肉萎缩、氧化应激和肌力下降。靶向这一蛋白-蛋白相互作用为DMD及其他难治性肌肉消耗性疾病提供了有前景的治疗新途径。