番荔枝同源四倍体高效诱导及生理特性改良研究

《Horticulturae》：Deciphering the Molecular Mechanisms That Control Ovule Development in Pomegranate

本综述系统总结了利用秋水仙素（colchicine）在番荔枝（Annona cherimola Mill. cv. Fino de Jete）中建立高效离体诱导同源四倍体（autotetraploid）植株的试验方案。研究通过下胚轴（hypocotyl）外植体处理，优化了多倍体诱导条件（0.1%秋水仙素，24 h），成功获得叶片形态改良（增大、变圆）、叶绿素含量（Chl a, Chl b）及光合效率（Chl a/Chl b ratio）显著提升的稳定四倍体株系，为果树育种提供了具有增强抗逆潜力的新种质。

　　

1. Introduction

番荔枝（Annona cherimola Mill.）是番荔枝科中最主要的栽培物种，原产于安第斯山脉的亚热带果树，已良好适应西班牙南部的亚热带条件，成为当地重要的经济作物，其中西班牙是世界番荔枝的主要生产国，而'Fino de Jete'是主导的商业栽培品种。离体组织培养技术已被开发用于番荔枝属物种的无性繁殖，例如番荔枝，从下胚轴切片实现多重不定芽再生已有报道，并且这种下胚轴再生能力也在刺果番荔枝（A. muricata）、番荔枝×糖苹果（atemoya）cv. African Pride以及糖苹果（A. squamosa）中得到证实。在先前关于番荔枝微繁殖的研究中，开发了一种从该物种离体萌发种子获得的下胚轴外植体再生多重不定芽的方案。由于不定芽再生频率高，下胚轴成为番荔枝诱导和回收多倍体植株的首选外植体。

番荔枝属包含一些四倍体物种，例如 Pond apple（A. glabra）、A. lutescens、A. mucosa、A. neolaurifolia 和 A. exsucca。然而，该属的大多数物种是二倍体，体细胞染色体数为 2n = 2x = 14。众所周知，番荔枝的胚乳组织是三倍体，但迄今为止，尚未有从番荔枝胚乳再生三倍体植株的报道。最近，有研究报道了在番荔枝属其他物种（atemoya，即番荔枝×糖苹果）的种间杂交后代中存在四倍体基因型，并评估了种间杂交衍生的花粉变化。

多倍体化可以对植物产生广泛的影响，这些影响具有物种依赖性，并受到每个物种的倍性和杂合度水平的强烈影响。多倍体化最引人关注的效果包括：由于不同物种间存在的倍性水平差异，提供了克服种间杂交障碍的机会；增加花和果实大小；获得无籽果实或种子数少的果实；提高对非生物胁迫和害虫的耐受性；以及诱导更高的营养生长活性和生产力。

植物染色体加倍主要通过使用抗有丝分裂物质如秋水仙素（colchicine）、oryzalin、trifluralin等来实现；这些物质能够诱导无丝分裂纺锤体失效，从而促进具有异常染色体数目的细胞产生。离体处理茎尖是诱导多倍体最普遍的方法之一，并已成功应用于许多植物物种，包括沙梨（Pyrus pyrifolia）、姜（Zingiber officinale）、石榴（Punica granatum）和枣（Zizyphus jujuba Mill.）。多倍体研究不仅限于果树，也在林木（如杨属Populus sp.、悬铃木属Platanus sp.、刺槐属Robinia sp.、桉树属Eucaliptus sp.等）、观赏植物（如Escallonia sp.、Hemerocallis sp.、Petunia sp.、Primula sp.等）、蔬菜（如芦笋Asparagus sp.和菠菜Spinacia sp.）以及经济作物（如咖啡Coffea sp.、啤酒花Humulus sp.、橡胶树Hevea sp.）中广泛开展。

抗有丝分裂剂可以在离体条件下应用于顶端和腋生分生组织以及种子，秋水仙素是在这些条件下最常用的，主要嵌入石蜡或胶凝剂等载体中；然而，这些处理大多成功率低且嵌合体比例高，使得这种方法在获得多倍体植株方面效率低下且不可靠。离体方法提供了从单细胞再生植物的可能性，减少了嵌合体的数量，并在不同植物物种（如果树木本物种，如沙梨、石榴、桑树；林木，如河北杨、刺槐；蔬菜，如大蒜、芦笋）中取得了更高的成功率。该方法已成为植物多倍体诱导的主要方法。

然而，使用秋水仙素的离体多倍体诱导方法与较高频率的嵌合体（混倍体）有关。该研究领域的结果表明，随着处理时间的缩短，混倍体的百分比降低。将嵌合体植株分离为纯合类型的有效方法涉及不定器官再生。

抗有丝分裂剂（秋水仙素）已在离体条件下应用于多种木本和草本植物，使用不同的外植体，例如茎尖和体细胞胚、腋芽、茎尖、根茎芽、叶片、种子、子叶、来自不同来源的愈伤组织等。

本研究旨在建立一种利用下胚轴外植体在番荔枝中离体诱导同源四倍体植株的方法，并分析秋水仙素对该物种不定再生和倍性改变的影响。该方法有望降低获得的混倍体比例，并最大化再生的纯合同源四倍体植株的数量。总体而言，本研究旨在进一步推动该物种的育种和新砧木/基因型及品种的开发，以拓宽其农学前景。

2. Materials and Methods

2.1. Plant Material and Disinfection

番荔枝（Annona cherimola）cv. Fino de Jete 种子按照 Padilla 和 Encina 描述的方案进行离体萌发。简言之，完整种子在 2% 次氯酸钠溶液中消毒 40 分钟，然后在含有 8.67 μM 赤霉酸（GA₃）的无菌蒸馏水中浸泡 24 小时。种子在真空条件下再用 1% 次氯酸钠溶液消毒 20 分钟，随后用无菌蒸馏水冲洗三次，然后进行离体培养。消毒后的种子在 30°C 黑暗条件下，置于含有（单位 mg L^?1）盐酸硫胺素（100）、盐酸吡哆醇（50）、烟酸（50）、甘氨酸（200）、肌醇（100）和 3% 蔗糖的基础 MS 液体培养基中的纸桥上培养，并补充 0.3 mg L^?1GA₃。pH 值在 121°C 和 1.05 Kg cm^?2压力下高压灭菌 20 分钟前调整至 5.7。本研究所有培养基均采用此 pH 值和高压灭菌条件。从 42 天龄幼苗上切取的下胚轴切片（约 1.5 cm）作为秋水仙素处理的初始外植体。

2.2. Induction of Autopolyploid Shoots

为诱导多倍化，将下胚轴切片（1.5 cm）置于含有 3 mL 经过滤灭菌的秋水仙素溶液（0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2%）的预先灭菌的锥形瓶（100 mL）中，在温和摇动（80 rpm）下培养 24 或 48 小时。处理后，将外植体纵向剖开，并将切面与培养基接触培养在培养皿中。每个培养皿接种 5 个外植体，置于 25 mL 补充有（单位 mg L^?1）盐酸硫胺素（100）、盐酸吡哆醇（50）、烟酸（50）、甘氨酸（200）、肌醇（100）、3% 蔗糖、0.8% Bacto-agar、0.15 mg L^?1BAP 和 200 mg L^?1经过滤灭菌的头孢噻肟的 MS 培养基上。每个秋水仙素处理（浓度 × 持续时间）培养 50 个外植体，视为一次独立实验。培养皿在 25 ± 2°C、16:8 小时（光:暗）光周期下培养，使用冷白色荧光灯管提供 45 μmol m^?2s^?1的光合有效辐射（400–700 nm），持续六周。记录每个处理的芽再生百分比（% shoot regeneration）以及每个有再生的外植体平均再生芽数（average shoot）。

为了芽的伸长，将再生的芽单独转移到含有 0.15 mg L^?1BAP（不含抗生素）的新鲜 MS 培养基中，置于带有聚丙烯盖的试管（150 mm × 25 mm）中。记录每个秋水仙素处理六周后的芽存活百分比。

2.3. Ploidy Analysis by Flow Cytometry

通过流式细胞术（Ploidy Analyser PA-I）在伸长阶段测定来自 24 小时处理的再生芽的倍性水平。取幼嫩叶片样品（约 0.5 cm²）在 0.4 mL 细胞核分离缓冲液中切碎 30–60 秒以释放细胞核。将匀浆通过 50 μm 尼龙网过滤；随后，用荧光染料对细胞核进行染色。最后，在孵育 30 秒后分析样品。以二倍体番荔枝 cv. "Fino de Jete"（2n = 2x = 14）作为外部标准。倍性水平根据相对于标准的 G₀/G₁峰通道值确定。每次分析包括超过 10,000 个细胞核，并独立重复三次。多倍体芽在培养中维持，并在六周后重新评估核 DNA 稳定性。计算每个秋水仙素浓度的多倍化百分比。

2.4. Multiplication and Rooting of Regenerated Shoots, and Acclimatization of Rooted Plantlets

将三个存活的自同源四倍体芽（Shoots 2069, 2083, 2084）进行增殖，以建立自同源四倍体番荔枝株系。将芽单独培养在含有 75 mL 芽再生培养基的 200 mL 广口瓶中，用聚丙烯盖覆盖并用塑料薄膜密封。广口瓶在 25 ± 1°C、16 小时光周期（45 μmol m^?2s^?1）下保存。每四周进行一次继代培养。

一旦从每个自同源四倍体株系获得足够数量的芽，采用 Encina 等人的方法进行生根诱导。首先将芽在补充有 0.1% 活性炭和 2% 蔗糖的 MS 培养基上光照培养 3 天，然后在含有 1.5% 蔗糖和 100 mg L^?1IBA 的 MS 培养基上培养 10 天（7 天黑暗/3 天光照）。最后，将芽转移到含有半强度 MS 大量元素和 2% 蔗糖的根伸长培养基上。六周后，记录生根芽的百分比，并将根系发育良好的小植株用自来水彻底冲洗后移栽到具有 4 × 4 cm 穴孔的聚乙烯托盘中，托盘内装有高压灭菌的沙/土（1:1）混合物。盆栽小植株在 80% 相对湿度的聚乙烯隧道中维持一个月。隧道内温度在 19°C 至 30°C 之间，平均温度为 25°C。驯化后的植株转移到含有相同基质的 9 cm 直径盆中，在 60% 相对湿度下再维持一个月，最后移栽到含有泥炭/沙-土（1:1）混合物的 12 cm 直径盆中，在 50% 相对湿度下维持两个月。实验期间定期浇水。植株在 80% 遮荫下生长。四个月后记录存活率数据。

作为对照，此过程也对倍性未被秋水仙素处理改变的二倍体芽进行。

2.5. Chromosome Observation

驯化后，通过细胞遗传学制备物再次确认自同源四倍体小植株的核 DNA 倍性水平。在再生植株长到 3 cm 高时进行染色体数目验证。从四倍体（4x）基因型和作为对照的经秋水仙素处理再生的二倍体基因型收集分生组织根尖（8–10 mm 长）。将它们置于饱和的 α-溴萘溶液中预处理 1 小时。彻底冲洗后，将根尖在 3:1 乙醇-乙酸中固定至少 24 小时。固定的根尖然后在 60°C 的 1N HCl 中水解 13 分钟，用水冲洗后，在无色碱性品红中黑暗染色 30 分钟。将染色良好的根尖切下，在 1% 乙酸洋红中压片。每个芽至少计数 3 个分散良好的中期相并在显微镜下拍照。

2.6. Characterization of the Leaves of Autotetraploid Cherimoyas

对自同源四倍体番荔枝的叶片进行了两次表征；使用了离体和活体植株。离体植株为生根 1 个月后的小植株，而活体植株为驯化 4 个月后获得。取样了属于三个四倍体基因型的离体小植株的十片叶子和来自二倍体基因型的十片叶子。用游标卡尺记录展开叶片的长度和宽度。对于四倍体和二倍体的活体植株，用卷尺测量了二十片叶子。分析并比较这些表征测量的结果，以研究两个倍性水平之间的差异。

分析大小后，使用相同的叶子评估叶绿素含量。番荔枝叶片叶绿素含量的分析采用 Goodwin 开发的方法；结果以鲜重（FW）mg g^?1表示。再次分析并比较这些表征测量的结果，以研究两个倍性水平之间的差异。

2.7. Statistical Analysis

本研究获得的所有数据均使用 SPSS 软件包（版本 22.0）进行分析。二项变量，如芽再生百分比、芽存活百分比和多倍化百分比，通过使用 Logit 作为连接函数、Binomial 作为概率分布的广义线性模型进行分析。组间成对比较采用 Fisher 最小显著差数（LSD）检验。正态变量，如外植体再生芽数和叶长、叶宽及叶绿素浓度，通过单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析，事后分析中使用 HSD-Tukey 检验进行组间比较。

3. Results

3.1. Induction of Autopolyploid