细胞死亡调控因子c-FLIPR通过抑制自然杀伤细胞功能加剧甲型流感病毒感染

《Journal of Molecular Medicine》：The cell death regulator c-FLIPR impairs natural killer cell responses during influenza a virus infection

本研究聚焦于细胞死亡调控因子c-FLIPR在抗病毒免疫中的未知功能。研究人员发现，在甲型流感病毒(IAV)感染中，c-FLIPR的组成性表达会导致病毒载量显著升高。机制研究表明，c-FLIPR通过抑制自然杀伤(NK)细胞的脱颗粒和细胞因子分泌，削弱了其抗病毒功能，揭示了c-FLIPR在调节先天免疫中的新作用。

　　

在病毒与宿主的军备竞赛中，细胞死亡是一把双刃剑。一方面，被病毒感染的细胞通过启动程序性死亡，可以“舍身取义”，在病毒完成复制前自我毁灭，从而限制病毒的传播。另一方面，过度的细胞死亡，特别是免疫细胞的死亡，会削弱机体的防御力量，反而为病毒大开方便之门。因此，细胞死亡的调控机制，尤其是那些能够决定细胞“生死”的关键蛋白，在抗病毒免疫中扮演着至关重要的角色。

其中，细胞型FLICE抑制蛋白(c-FLIP)是细胞凋亡通路中的一个关键“刹车”。它通过抑制死亡受体介导的凋亡信号，保护细胞免于过早死亡。c-FLIP家族有多种亚型，其中c-FLIP_L和c-FLIP_S的功能研究较为深入，但另一种亚型c-FLIP_R在免疫系统中的作用却一直是个谜。

为了揭开c-FLIP_R的神秘面纱，德国波鸿鲁尔大学Ingo Schmitz教授团队与亥姆霍兹感染研究中心等机构的研究人员合作，利用一种特殊的转基因小鼠模型——vavFLIP_R小鼠，深入探究了c-FLIP_R在甲型流感病毒(IAV)感染过程中的作用。这项研究于2025年10月13日被《Journal of Molecular Medicine》接收，并于同年12月26日在线发表。

研究人员发现，与预期相反，在甲型流感病毒面前，c-FLIP_R非但没有保护宿主，反而成了病毒的“帮凶”。表达c-FLIP_R的小鼠表现出更高的病毒载量和更严重的病理损伤。深入探究其机制，研究团队将目光投向了免疫系统的“先锋部队”——自然杀伤(NK)细胞。他们发现，c-FLIP_R的表达导致感染小鼠体内NK细胞数量异常增多，但这些NK细胞却“出工不出力”，其杀伤病毒的能力和细胞因子的分泌能力均显著下降。这项研究不仅揭示了c-FLIP_R在抗病毒免疫中的新功能，也为理解病毒感染过程中免疫细胞功能失调提供了新的视角。

关键技术方法

本研究主要采用了vavFLIP_R转基因小鼠模型，该模型在所有造血细胞中组成性表达小鼠c-FLIP_R。通过体内感染实验，研究人员对小鼠进行了甲型流感病毒(IAV)攻毒，并系统评估了其体重变化、疾病评分、病毒载量及组织病理学改变。在细胞水平，研究利用流式细胞术分析了免疫细胞亚群、活化状态、凋亡及功能（如脱颗粒和细胞因子分泌）。此外，通过体外感染实验，结合RT-qPCR和病毒滴度测定，评估了IAV对NK细胞的感染能力及病毒复制情况。

研究结果

vavFLIP_R小鼠在甲型流感病毒感染期间病毒载量更高

为了评估c-FLIP_R在抗病毒免疫中的作用，研究人员用甲型流感病毒(IAV)感染了vavFLIP_R转基因小鼠和野生型(WT)对照小鼠。结果显示，虽然两组小鼠的体重下降趋势相似，但vavFLIP_R小鼠在感染高峰期（第9天）表现出更高的疾病评分。更重要的是，病毒载量分析揭示了一个关键差异：在感染早期（第1-2天），两组小鼠的病毒水平相当；但从第3天开始，vavFLIP_R小鼠肺部的病毒载量显著高于野生型小鼠，并在第7天达到峰值，其病毒RNA拷贝数比野生型高出15.1倍。通过病灶形成试验和肺部组织病理学分析进一步证实，vavFLIP_R小鼠体内存在更多具有复制能力的病毒颗粒和更广泛的病毒感染区域。这些结果表明，c-FLIP_R的表达加剧了IAV感染的严重程度。

IAV感染期间vavFLIP_R小鼠NK细胞数量增加

为了探究病毒载量升高的原因，研究人员对感染小鼠的免疫细胞进行了全面分析。结果显示，在感染高峰期（第7天），vavFLIP_R小鼠和野生型小鼠的中性粒细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞的数量没有显著差异。然而，一个引人注目的现象是，vavFLIP_R小鼠的脾脏、纵隔淋巴结和支气管肺泡灌洗液中，自然杀伤(NK)细胞的数量和比例均显著高于野生型小鼠。动力学分析表明，这种NK细胞的积累在感染第7天最为明显。此外，研究人员还发现，vavFLIP_R小鼠的NK细胞中c-FLIP总mRNA表达量远高于野生型，这主要归因于c-FLIP_R的表达。有趣的是，尽管NK细胞数量增多，但c-FLIP_R的表达并没有显著影响NK细胞在感染过程中的凋亡水平，提示NK细胞的积累并非由细胞存活率提高所致。

NK细胞耗竭消除了vavFLIP_R和野生型小鼠之间的病毒载量差异

为了验证NK细胞在vavFLIP_R小鼠高病毒载量表型中的作用，研究人员在感染前和感染过程中，使用抗Asialo-GM1抗体耗竭了小鼠体内的NK细胞。耗竭实验证实，该处理有效清除了小鼠体内的NK细胞。结果显示，在耗竭NK细胞后，无论是vavFLIP_R小鼠还是野生型小鼠，其肺部病毒载量均显著高于未耗竭的对照组，这证实了NK细胞在控制IAV感染中的保护作用。然而，最关键的是，在耗竭NK细胞后，vavFLIP_R小鼠和野生型小鼠之间的病毒载量差异消失了。这一结果有力地证明，vavFLIP_R小鼠中NK细胞数量的增加是导致其病毒清除能力受损、病毒载量升高的直接原因。

甲型流感病毒以非生产性方式感染小鼠NK细胞

既然NK细胞数量增加反而导致病毒清除能力下降，研究人员推测IAV可能直接影响了NK细胞的功能。为了验证这一点，他们首先检测了IAV是否能感染NK细胞。体外实验表明，IAV确实能够感染从脾脏中分离出的原代小鼠NK细胞，并能在细胞内检测到病毒NP基因的RNA。然而，当研究人员将感染了IAV的NK细胞上清液转移到MDCK细胞（一种对IAV敏感的细胞系）上时，却无法在MDCK细胞中检测到病毒复制。这表明，IAV虽然能够进入NK细胞并进行有限的复制，但无法产生具有感染性的子代病毒，即感染是“非生产性”的。此外，IAV感染并未导致NK细胞大量死亡，说明病毒对NK细胞的影响并非通过直接裂解细胞。

c-FLIP_R转基因NK细胞在IAV感染期间脱颗粒和细胞因子表达受损

最后，研究人员深入探究了c-FLIP_R表达如何影响NK细胞的功能。体外杀伤实验显示，在标准条件下（以YAC-1细胞为靶标），vavFLIP_R小鼠和野生型小鼠的NK细胞杀伤能力没有差异。然而，在体内感染IAV后，情况发生了改变。研究人员通过检测细胞表面CD107a的表达来评估NK细胞的脱颗粒能力（即释放杀伤性颗粒的能力），发现来自感染vavFLIP_R小鼠的NK细胞，其脱颗粒水平显著低于野生型小鼠。此外，对NK细胞效应分子的分析显示，来自vavFLIP_R小鼠的NK细胞，其颗粒酶B、肿瘤坏死因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)的表达水平也呈下降趋势。这些结果表明，在IAV感染过程中，c-FLIP_R的表达抑制了NK细胞的杀伤活性和细胞因子分泌功能，使其无法有效清除病毒。

结论与讨论

本研究通过体内外实验相结合的方法，系统阐明了细胞死亡调控因子c-FLIP_R在甲型流感病毒(IAV)感染中的新作用。研究团队发现，c-FLIP_R的组成性表达非但没有增强抗病毒免疫，反而通过损害自然杀伤(NK)细胞的功能，导致病毒载量升高和疾病加重。

研究揭示了几个关键机制：首先，IAV能够以非生产性方式感染NK细胞，这意味着病毒能够进入NK细胞并干扰其功能，但不会导致细胞裂解。其次，c-FLIP_R的表达虽然导致了感染小鼠体内NK细胞数量的积累，但这些细胞的功能却严重受损，表现为脱颗粒能力下降以及效应细胞因子（如TNFα和IFNγ）分泌减少。最后，通过体内NK细胞耗竭实验，研究证实了NK细胞是c-FLIP_R介导的免疫抑制效应的关键执行者。

这项研究的意义在于，它首次揭示了c-FLIP_R在抗病毒免疫中的“双刃剑”作用。在之前的研究中，c-FLIP_R被证明可以通过抑制T细胞凋亡来增强对李斯特菌的清除。然而，在IAV感染中，c-FLIP_R却扮演了负面角色，它通过一种不依赖于细胞凋亡的机制，削弱了NK细胞的抗病毒功能。这提示我们，细胞死亡调控蛋白的功能具有高度的环境依赖性，其作用可能因病原体类型和感染阶段的不同而截然相反。

研究人员在讨论中提出了一个有趣的潜在机制：c-FLIP_R可能通过干扰干扰素调节因子3(IRF3)的活性来抑制NK细胞的功能。IRF3是抗病毒天然免疫反应中的关键转录因子，对NK细胞产生颗粒酶B和IFNγ至关重要。虽然这一机制在本文中尚未被直接证实，但它为未来的研究指明了方向。

总之，这项研究不仅增进了我们对c-FLIP蛋白家族功能多样性的理解，也为开发针对流感等病毒感染的新治疗策略提供了新的靶点。它提醒我们，在抗病毒免疫中，免疫细胞的数量并非越多越好，其功能状态才是决定胜负的关键。