《Microbial Biotechnology》：A Modified Method Incorporating Multiplex PCR Reveals Fusobacterium Prevalence in Southern Chinese Population and Its Correlations in Cancers
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本刊推荐：本研究通过大规模比较基因组学分析，开发了一种高精度多重PCR（聚合酶链式反应）检测方法，可同步鉴定五种常见梭杆菌属（Fusobacterium）物种（包括具核梭杆菌等）及四个具核梭杆菌亚种。应用该方法，研究者揭示了梭杆菌属在南方中国人群及癌症患者中的流行特征，发现具核梭杆菌为优势菌种，并明确了不同物种与宿主条件（如血脂、血糖）及多种癌症（如结直肠癌CRC、肺癌）的相关性。尤为重要的是，研究指出死亡梭杆菌（F. mortiferum）相较于其他物种在癌症诊断中表现出更优性能，且结合BMI（身体质量指数）、Hb（血红蛋白）等临床指标构建的逻辑回归模型对癌症具有极佳诊断价值（AUROC=0.9183）。该研究为深入探究梭杆菌属在健康和疾病中的作用提供了精准工具和重要见解。
1 引言
梭杆菌属（Fusobacterium）是一类革兰阴性厌氧杆菌，常定植于口腔、胃肠道等部位，传统上被视为机会性病原体。近年来越来越多的证据表明，梭杆菌属，尤其是其模式物种具核梭杆菌（F. nucleatum），与人类疾病特别是癌症的发生发展密切相关。例如，在结直肠癌（CRC）患者的肠道和肿瘤组织中，具核梭杆菌的丰度显著高于健康个体，并在CRC发展中扮演重要角色。此外，具核梭杆菌的水平还与食管癌、胰腺癌、胃癌等多种肿瘤的预后不良及化疗反应差相关。
然而，除具核梭杆菌外，对其他梭杆菌属物种（如死亡梭杆菌、F. ulcerans、F. varium、F. necrophorum等）及其潜在致病性的了解仍非常有限。已有研究提示，不同检测方法可能会影响对特定人群中微生物靶标的识别，这凸显了开发高精度检测方法以鉴定常见梭杆菌物种和亚种的迫切性。本研究旨在通过大规模比较基因组学，鉴定梭杆菌属物种及亚种特异性遗传标记，进而开发一种高精度多重PCR检测方法，并利用该方法探究梭杆菌属在南方中国人群及癌症患者中的流行特征和临床意义。
2 材料与方法
2.1 菌株
研究使用了包括具核梭杆菌不同亚种（如nucleatum, polymorphum, vincentii, animalis）及其他梭杆菌物种（如F. necrophorum）在内的标准菌株（来自ATCC等保藏中心）以及从临床粪便样本中分离鉴定的多种菌株（如F. mortiferum, F. varium, F. ulcerans等），并采用微生物质谱检测系统和16S rRNA基因测序进行确认。
2.2 梭杆菌基因组分析及物种特异性遗传标记鉴定
从NCBI数据库共获取217个梭杆菌基因组，经过筛选后纳入214个独特基因组进行泛基因组分析。通过IPGA平台进行下游比较基因组分析，包括系统发育分析、核心基因等位基因分析和基因组注释分析。筛选在物种内高度保守、同时在物种间差异显著的序列区域作为核心基因候选，并通过与NCBI核苷酸数据库比对排除与其他生物体存在同源序列的基因，最终确定物种或亚种特异性标记。
2.3 PCR引物和探针的设计
基于上述筛选到的特异性核心序列，针对不同的梭杆菌物种和亚种设计PCR引物和探针。所有引物具有相似的熔解温度（Tm），扩增子大小控制在80-200 bp之间。通过Primer Express软件分析引物和探针形成自身二聚体、交叉二聚体及发夹结构的情况。最终确定的引物退火温度在48.3°C至64.0°C之间，GC含量为21.0%–43.0%，长度20-33个核苷酸；探针退火温度在64.8°C至70.0°C之间，GC含量为29.0%–50.0%，长度20-26个核苷酸。
2.4 多重实时PCR检测方法的建立
PCR反应在ABI 7500实时PCR检测系统上进行。通过单靶标荧光PCR筛选各靶标的最佳引物-探针组合，然后随机组合成多重系统进行进一步筛选，确定不同靶标的最佳配置。最终通过确定引物和探针的浓度梯度（100–1000 nM），优化多重系统中的引物和探针用量，选择具有良好扩增曲线且无交叉反应的组合，建立有效的多重反应体系。最终筛选出三组引物组（Primer Set A, B, C）用于多重PCR检测系统。并通过qPCR和ddPCR评估该方法的扩增效率、灵敏度和特异性。结果表明，该检测系统对1 × 103copies/mL的DNA具有95%的检测率，Cut-off Cq值设定为42，且与其他常见肠道菌无交叉反应，显示出良好的特异性和灵敏度。
2.5 DNA制备
细菌DNA使用细菌DNA提取试剂盒制备。队列研究中的粪便和组织样本DNA使用相应的商业试剂盒提取，并通过分光光度计测定浓度。
2.6 研究设计与研究人群
本研究包含三个队列：
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队列A（广东肠道微生物组计划GGMP）：纳入498名受试者，用于分析南方中国人群中梭杆菌属的流行情况。
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队列B（临床癌症队列）：在南方医科大学珠江医院纳入397名参与者，包括308例实体癌患者和89例非癌症对照，用于分析实体癌患者肠道中梭杆菌群落的组成特征。
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队列C（组织样本队列）：纳入接受手术切除的CRC和肺癌患者，收集其配对的肿瘤组织、癌旁组织、正常组织及粪便样本，用于分析这些临床样本中梭杆菌群落的组成特征及其与CRC和肺癌的相关性。
本研究经相关伦理委员会批准。
2.7 统计分析
使用GraphPad Prism、SPSS和R软件进行统计分析。采用卡方检验比较率，Mann-Whitney U检验比较测量值。多组比较采用Kruskal-Wallis H检验 followed by Dunn's检验。p < 0.05认为有统计学意义。
3 结果
3.1 大规模比较基因组学分析鉴定梭杆菌属物种特异性遗传标记
对214个梭杆菌基因组的分析显示，菌株在系统发育树上形成8个分支，分别对应具核梭杆菌的4个亚种以及死亡梭杆菌、F. ulcerans、F. varium和F. necrophorum这5个物种。通过IPGA分析，鉴定出每个物种/亚种特异的核心基因或序列，这些标记在物种内具有高度保守性（中位一致性99.7%），且在NCBI数据库中未发现与其他生物体的同源物。
3.2 开发用于鉴定梭杆菌物种和亚种的高精度多重PCR检测方法
基于鉴定的特异性核心序列，设计了针对不同梭杆菌物种和亚种的特异性引物和探针。通过优化反应条件，最终确定三组引物组的最佳浓度，并验证了其特异性（对33种非靶标菌株无交叉反应）。灵敏度测试表明，该检测方法对1 × 103copies/mL的靶标DNA混合物具有95%的检测率。扩增效率在90.465%至101.183%之间，R2值在0.995至1之间，表明该方法高效且稳定。
3.3 应用多重PCR检测方法分析南方中国人群中梭杆菌属的分布
对GGMP队列498名个体的分析显示，梭杆菌属在人群中的检出率为69.08%。其中，具核梭杆菌最为普遍（45.78%），其次是死亡梭杆菌（35.34%）、F. varium（12.45%）、F. ulcerans（9.84%）和F. necrophorum（0.60%）。在具核梭杆菌亚种水平，animalis亚种最普遍（26.10%），其次是vincentii（13.65%）、nucleatum（13.05%）和polymorphum（11.65%）。相关性分析发现，具核梭杆菌nucleatum亚种和死亡梭杆菌与低密度脂蛋白胆固醇（LDL）和总胆固醇显著相关，nucleatum亚种还与空腹血糖和血尿素氮相关。其他物种/亚种也与布里斯托大便分类、饮食习惯、HbA1c等宿主参数存在显著正相关或负相关。
3.4 应用多重PCR检测方法分析癌症患者中梭杆菌属及其诊断性能
在临床癌症队列中，具核梭杆菌在癌症患者和对照中均为最普遍的物种。与对照组相比，癌症患者粪便中梭杆菌属，尤其是具核梭杆菌、死亡梭杆菌、F. ulcerans和F. necrophorum的载量显著更高。相关性分析显示，在癌症患者中，polymorphum亚种和死亡梭杆菌与肿瘤类型相关，nucleatum亚种和polymorphum亚种与血红蛋白（Hb）相关，F. ulcerans和F. varium与体重相关等。诊断性能评估显示，死亡梭杆菌对癌症的诊断性能（AUROC 0.7109）优于具核梭杆菌（0.5915）、F. ulcerans（0.5730）和F. necrophorum（0.5692）。更重要的是，结合具核梭杆菌、死亡梭杆菌、BMI和Hb的逻辑回归模型显示出极高的诊断准确性（AUROC = 0.9183）。此外，在未经治疗的癌症患者、经治疗患者和对照组中，梭杆菌的流行率和载量也存在差异，特别是死亡梭杆菌在癌症组载量急剧增加，但在治疗后显著下调。
3.5 应用多重PCR检测方法分析CRC和肺癌患者配对肿瘤组织中的梭杆菌属
在CRC患者中，肿瘤组织（93.33%）和癌旁组织（100%）的梭杆菌检出率高于正常组织（87.50%）。除F. necrophorum外，具核梭杆菌、死亡梭杆菌、F. ulcerans和F. varium在肿瘤组织中的检出率均高于正常组织。在亚种水平，仅animalis亚种的检出率在肿瘤组织到正常组织呈下降趋势。值得注意的是，F. varium在肿瘤组织中的载量显著高于癌旁和正常组织。肿瘤组织中通常存在多种梭杆菌物种/亚种的混合感染，且物种数多于正常组织。
在肺癌患者中，肿瘤组织中的梭杆菌检出率（21.74%）高于癌旁组织（17.39%）和正常组织（11.11%），但远低于CRC组织。仅在肺癌组织中检测到具核梭杆菌和F. ulcerans。粪便中梭杆菌与宿主参数的相关性分析显示，F. varium与心率（HR）相关，animalis亚种与鳞状细胞癌抗原（SCC）相关等。肺癌组织与粪便中的梭杆菌流行特征未发现显著一致性。
4 讨论
本研究通过大规模比较基因组学分析，成功开发了一种高精度多重PCR检测方法，可同步鉴定五种常见梭杆菌物种及四个具核梭杆菌亚种。应用该方法，揭示了在南方中国人群（无论健康状况）中，具核梭杆菌均为最普遍物种，这与之前基于16S rRNA基因测序（分辨率有限，难以区分物种）的研究结论（认为非具核梭杆菌占主导）不同，凸显了精准检测方法的重要性。研究还明确了不同梭杆菌物种/亚种与宿主条件及多种癌症的关联，并发现死亡梭杆菌在癌症诊断中表现出优于具核梭杆菌的性能。结合临床指标（BMI, Hb）的诊断模型效能卓越。研究还揭示了梭杆菌载量在癌症治疗前后的动态变化，以及在CRC和肺癌组织中存在不同的定植模式（肺癌组织检出率低，可能与组织嗜性有关）。
本研究存在一些局限性，如未全面阐述不同梭杆菌物种间的相互作用、样本量相对有限、以及因荧光通道限制将检测分为三组引物组（属于改良的多重qPCR assay）等。未来需要更大规模的队列研究以及技术整合。
总之，本研究开发的检测方法为未来研究梭杆菌在疾病中的作用提供了有力工具。研究结果有助于阐明不同梭杆菌成员与各种实体癌的关联，并为精准探究其致癌机制指明了方向。
