《Movement Disorders》：Uncovering the Complexity of Synucleinopathies: An Ongoing Tale Between Proteins and Lipids
aSyn与神经节苷脂的相互作用
神经节苷脂作为神经元细胞膜中最丰富的脂质种类之一，其静电特性使其能够通过非共价键与蛋白质相互作用。在帕金森病（PD）中，神经节苷脂GM1被认为具有神经保护作用。然而，其化学物理性质的失衡可能参与病理过程。
体外研究和细胞模型表明，GM1主要由神经元合成。在酸性条件下，GM1和GM3可诱导aSyn单体发生构象变化，促进其聚集。这种效应由神经节苷脂头基在膜表面的静电相互作用驱动。aSyn的N端结构域在与带负电的膜相互作用时呈现α-螺旋构象，这可能将蛋白质浓缩在膜表面，促进aSyn成核和纤维形成。此外，aSyn不仅能与富含神经节苷脂的膜结合，还能在聚集过程中与GM1和GM3共组装，导致这两种神经节苷脂从膜上耗竭。这表明神经节苷脂不仅在某些条件下可作为成核剂，还是aSyn聚集体的关键组成部分。
与某些研究中报道的神经节苷脂促进聚集的效应相反，在原代多巴胺能神经元培养物中的研究表明，GM1的完整寡糖头基（GM1-OS）对aSyn聚集具有保护作用。GM1-OS在体外可防止aSyn自发聚集，且不会诱导aSyn的二级结构改变，表明其能保护蛋白质的非致病天然状态。GM1-OS处理还能显著提高神经元存活率并保护多巴胺能神经元免受aSyn寡聚体毒性。
在SH-SY5Y和NG108-15细胞中使用神经酰胺类似物PPMP抑制GM1合成的研究发现，当细胞暴露于PPMP时，aSyn的聚集形式增加。相反，补充GM1可以保护细胞免受MPP+的神经毒性作用。因此，GM1的存在对于稳定aSyn的天然状态是必要的。脑裂解物研究还发现，GM1不仅存在于膜上，也能以游离形式存在于细胞质中，并通过非共价相互作用与aSyn结合。
除GM1外，多不饱和脂肪酸（PUFAs）如二十二碳六烯酸和花生四烯酸也能稳定胞质和膜结合的aSyn。与年龄相关的PUFA下降和脂质过氧化增加会减少保护性脂质复合物，同时促进氧化应激和aSyn介导的活性氧（ROS）产生。然而，GM1在稳定胞质aSyn方面的具体贡献相较于其他脂质（如PUFAs）仍不清楚。
这些结果表明，神经节苷脂种类的平衡对于（1）将aSyn吸引至膜表面和（2）在胞质中稳定其未折叠的天然状态至关重要。当这种平衡被打破时，aSyn获得非天然未折叠状态，更容易在膜表面成核和积累，并将脂质捕获到聚集体中。
体内模型证据进一步支持了神经节苷脂在aSyn病理中的作用。B4galnt1基因敲除（KO）小鼠由于缺乏GM2合酶（由B4galnt1基因编码），导致复杂神经节苷脂（如GM1）耗竭。这些小鼠出现进行性运动缺陷，黑质（SN）中aSyn积累显著增加。给予GM1类似物可改善aSyn病理，减少酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元的丢失，并减轻PD样症状。在过表达A53T aSyn突变体的小鼠模型中，GM1给药也能减少aSyn聚集并保护多巴胺能神经元。GM1的作用可能不仅源于其在质膜上的存在，还因为它能结合并稳定aSyn的可溶功能形式，防止有毒聚集体的形成，并可能通过细胞信号传导产生副作用。
GM1含量在衰老过程中可下降约22%，当酶活性受损时可下降50%。这可能导致膜流动性增加，改变并影响脂筏和突触小泡的完整性，可能改变脂质与蛋白质的比例。这表明GM1的膜稳定特性和脂筏组织能力的丧失可能损害aSyn向膜的募集以及膜结合aSyn的构象稳定性，促进其从通常具有保护作用的膜相关螺旋状态转变为易于聚集的构象。
此外，GM1作为磷脂双分子层的重要组成部分，可促进膜受体（如胶质细胞系源性神经营养因子受体α1（GFRα1）和重排 during transfection（RET）受体）的二聚化，这两者对于GDNF信号传导至关重要。B4galnt1 KO小鼠中GM1的缺乏损害了黑质中GDNF受体复合物的形成，从而阻断了GDNF信号传导。这对多巴胺的合成和释放以及多巴胺能神经元的存活有直接影响。
人类研究显示，PD患者的黑质、脑脊液（CSF）和血清中GM1水平显著降低。这可能是由于GM2合酶活性受损所致，因为在PD患者的黑质中发现了该酶的减少以及类似神经节苷脂的耗竭。基于这些发现，GM1被认为是潜在的治疗靶点，使用GM1的人类临床试验正在进行中。有趣的是，皮下注射GM1的患者显示出运动症状的显著改善。然而，需要进一步的临床试验来充分评估这种神经节苷脂作为生物标志物和/或治疗剂的潜力。
aSyn、神经酰胺和鞘脂
鞘脂是大脑中最丰富的脂质家族。多项研究显示，PD和DLB患者的黑质和血清中，神经酰胺和其他鞘脂（不同于神经节苷脂）的脂质谱发生变化。这些变化导致细胞膜刚性增加，损害了依赖于脂筏的神经营养信号传导等神经元过程，使神经元对谷氨酸兴奋性毒性等神经毒性事件更易感。
体外和细胞模型系统建立了神经酰胺和鞘脂代谢与aSyn聚集之间的强有力机制联系。在过表达aSyn的HEK293、Neuro2a和SH-SY5Y细胞中，拉曼光谱和脂质组学分析显示，在聚集过程中鞘磷脂显著减少，同时神经酰胺水平增加。此外，SH-SY5Y细胞暴露于高分子量aSyn物种与酸性鞘磷脂酶（ASM）活性增加相关，ASM可能降解质膜中的鞘磷脂，释放神经酰胺，这是细胞死亡的一个主要因素。aSyn寡聚体的高浓度还会通过抑制线粒体复合物I和引起溶酶体破裂来增加ROS产生，增加了病理机制的复杂性。
在携带aSyn基因（SNCA）重复的人iPSC来源的神经元中，与正常aSyn基因剂量的神经元相比，检测到神经酰胺、二氢神经酰胺和二氢鞘磷脂的显著增加，同时单己糖基神经酰胺和乳糖基神经酰胺（LacCer）等复杂鞘脂减少。这进一步将aSyn基因剂量与神经元背景下的鞘脂失调联系起来。在SH-SY5Y细胞中，使用myriocin药物抑制神经酰胺合成，可在细胞用预形成的aSyn原纤维处理时减少aSyn聚集体。这种减少与TFEB核转位增加相关，从而启动自噬程序，将aSyn导向溶酶体降解。
神经酰胺代谢是参与其他脂质种类合成的众多分支之一。葡萄糖神经酰胺（GlcCer）是由神经酰胺产生的脂质种类，参与神经元发育、维持和突触活性调节，同时也与神经退行性变有关。GBA1基因编码β-葡萄糖脑苷脂酶（GCase），这是一种参与溶酶体中鞘脂代谢（特别是GlcCer）的酶。值得注意的是，GBA1基因的杂合突变被认为是PD和DLB的主要遗传风险因素。
来自携带L444P GBA1突变个体的成纤维细胞显示，与特发性PD和对照成纤维细胞相比，总鞘磷脂、神经酰胺和己糖基神经酰胺增加，长链鞘脂减少。这些突变成纤维细胞的脂质提取物与重组aSyn在体外孵育显著加速了聚集过程，产生了富含短链鞘脂的淀粉样原纤维。重要的是，用GCase伴侣蛋白ambroxol对这些成纤维细胞进行鞘脂稳态的药理学调节，可通过减少GlcCer使鞘脂谱正常化，并消除促聚集效应。
在来自携带L444P和N370S GBA1突变患者的iPSC来源的多巴胺能神经元或SH-SY5Y GBA1-KO模型中的研究进一步表明，GCase活性受损导致GlcCer积累、aSyn寡聚化增加和细胞外aSyn物种的积累。此外，GlcCer诱导aSyn从无毒单体状态向有毒、富含β-折叠的寡聚体进行双向、可逆的转化，这些寡聚体损害神经元活力，而移除GlcCer可逆转这一过程。这表明升高的GlcCer可以直接驱动有毒aSyn物种的形成，而不依赖于GBA1突变状态。
GCase功能障碍与aSyn病理之间的双向关系，即aSyn聚集体进一步损害GCase活性，导致GlcCer积累，在GBA1相关的突触核蛋白病的发病机制中形成了一个恶性循环。因此，对GlcCer水平的药理学或遗传学操作持续地挽救了aSyn病理，这突出了连接GBA1突变、鞘脂失调和aSyn聚集的一个强有力的机制通路。
体内模型研究同样确立了神经酰胺和鞘脂改变在促进aSyn聚集中的直接机制联系。携带GBA1基因杂合突变的小鼠再现了PD的关键特征，包括进行性运动缺陷和多巴胺能神经退行性变，并一致显示大脑中GCase活性降低。这种酶缺陷导致神经元中糖鞘脂底物，特别是GlcCer、葡萄糖鞘氨醇（GlcSph）和神经酰胺的积累。
有趣的是，携带aSyn和GBA1两种突变变体的双转基因或KO小鼠出现显著的突触核蛋白病相关表型，远远超过单突变或野生型（WT）对照组中观察到的效应。这些模型显示黑质中不溶性aSyn聚集体的快速积累，以及神经元鞘脂谱的改变。值得注意的是，通过AAV在3K（E35K + E46K + E61K）aSyn转基因小鼠中过表达WT GBA1可恢复GCase活性，减少富含脂质的aSyn聚集体，并改善运动和认知缺陷。
尽管GlcCer和GlcSph如何促进aSyn聚集的机制尚不清楚，但独立的体内研究表明它们具有驱动aSyn寡聚化和随后聚集的强大能力。这种增强的活性似乎源于其物理化学性质，不仅有利于异常蛋白质折叠，还能稳定有毒的寡聚中间体。相反，在WT-aSyn过表达转基因小鼠模型中使用GlcCer合酶抑制剂venglustat治疗会导致鞘脂水平改变并减少aSyn病理，进一步证实了这些脂质物种在突触核蛋白病中的作用。
人类研究利用死后脑组织、脑脊液和血清提供了鞘脂代谢在突触核蛋白病中致病作用的可测量证据。在PD患者，特别是携带GBA1突变的患者中，黑质、脑脊液和血清中的GCase活性显著降低。这种缺陷导致糖鞘脂底物（如GlcCer和LacCer）在生物体液中积累。这些底物的积累与年龄和疾病严重程度相关，使其成为潜在的生物标志物。
PD和DLB的大脑，以及脑脊液和血清样本，一致显示总神经酰胺增加，并向短链神经酰胺和鞘脂种类转变。此外，某些神经酰胺种类与运动严重程度和认知衰退等临床特征相关。液体生物标志物反映了大脑中观察到的变化：GBA-PD患者的脑脊液中下游神经酰胺升高，携带严重GBA1变异的患者升高幅度最大；早期PD队列显示脑脊液C18:0神经酰胺增加。在外周，血浆研究显示GBA-PD患者总己糖基神经酰胺升高，同时极长链神经酰胺并行耗竭。
在此背景下，进行了抑制鞘脂合成的化合物的临床试验，如Venglustat。Venglustat是一种葡萄糖神经酰胺合酶（GCS）抑制剂，可减少GlcCer和其他复杂糖鞘脂的合成。该化合物旨在解决携带GBA1基因突变的PD患者中鞘脂的病理性积累。尽管在1期试验中显示出有利的药代动力学和药效学，但在2期试验中，该药物未能减缓疾病进展，并且在高风险突变患者中的疗效低于轻度突变患者。这些有趣的结果表明，针对鞘脂积累的底物减少疗法需要更多的研究来理解为何仅靶向一种酶或通路在神经退行性变中未能转化为临床益处。
aSyn与磷脂
磷脂是神经元膜的主要组成部分，在细胞信号传导、膜运输和突触可塑性中发挥动态作用。大脑中磷脂的稳态和组成受到严格调控，其紊乱可导致神经元功能障碍和神经退行性变。膜磷脂组成或氧化的变化可以改变aSyn等蛋白质与膜的相互作用。此外，线粒体磷脂，特别是心磷脂的破坏会损害能量产生并增加对细胞凋亡的易感性。因此，磷脂不仅是 passive 结构元件，也是神经元健康的 active 参与者。
体外重建系统、模型膜和各种细胞模型的研究已经表征了不同类别和种类的磷脂如何塑造aSyn的生物物理行为，影响其不仅与膜结合的能力，还影响其聚集过程和由此产生的细胞毒性。
在脂质体实验和支持性双层系统中，一致证明aSyn对带负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰甘油（PG））表现出强烈的优先结合，优于其两性离子对应物，如磷脂酰胆碱（PC）。原子力显微镜和荧光实验表明，aSyn可以主动重塑、破坏甚至与脂质双分子层共聚集。例如，aSyn可以“穿孔”富含PG的双层结构，并提取脂质，这些脂质共组装填充β-折叠原纤维的中心空腔。有趣的是，这些相互作用对脂质与蛋白质的比例高度敏感：较低的比例有利于脂质被强烈螯合到生长的蛋白质原纤维中，而在较高比例下，囊泡可能仅与新兴的聚集体松散结合，形成超分辨率显微镜下可见的“项链”状形态。
在从SH-SY5Y神经母细胞瘤到患者来源的多巴胺能神经元的细胞模型中，aSyn的外源性应用和转基因驱动的过表达都通过激活磷脂酶通路和重新连接膜生物合成来产生磷脂改变。在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞和N27多巴胺能神经元细胞系中，WT或突变aSyn变体（如A53T）的过表达激活了胞质磷脂酶A2（PLA2），水解膜磷脂并诱导脂滴生物合成。有趣的是，阻断PLA2的活性会减少脂质积累，但细胞对aSyn过表达变得更敏感，可能是由于通过蛋白质-脂质相互作用增加了成核和聚集。
另一种重要的磷脂是心磷脂，它存在于线粒体膜中。aSyn可以与线粒体膜结合，在Lund人中脑多巴胺能神经元（LUHMES）中进行实验表明，aSyn的积累直接影响线粒体膜电位，导致线粒体ROS积累、呼吸作用丧失和caspase依赖性死亡激活。这些效应与内心磷脂膜的耗竭及其暴露于外膜有关。在HEK293和HeLa细胞中，aSyn的光遗传学控制聚集（LIPA系统）提供了该过程的高分辨率动力学，表明新生的胞质aSyn簇与线粒体进行短暂的“亲吻-奔跑”式接触，这反过来诱导心磷脂外化并招募LC3，从而导致线粒体自噬。有趣的是，如果阻止心磷脂暴露，就可以避免线粒体自噬并重建稳态，这强烈表明了一种从聚集体到脂质重塑再到细胞器丢失的机制。
此外，使用携带SNCA重复或A53T/E46K突变的患者来源的多巴胺能iPSC神经元的研究表明，PS和多不饱和PG/PE种类增加，并且心磷脂向线粒体外膜的易位束缚了单体aSyn并播种聚集。有趣的是，SNCA突变与成熟神经元中的线粒体应激相关，并且这种应激是在发育早期响应于存在于线粒体膜上的aSyn而启动的。这种关联伴随着线粒体表面电荷的丧失，这是由心磷脂在线粒体外膜上的暴露引起的。随后发生线粒体断裂；因此，这种现象可能代表病理的早期标志。
这些模型重现了前面提到的结果，即存在一致的磷脂失衡特征。总之，aSyn过量或聚集扰乱了膜脂质组成，暴露心磷脂，并破坏了线粒体完整性，从而为神经元功能障碍和神经退行性变设定了场景。
体内模型研究在生理背景下剖析了磷脂相关过程如何影响突触核蛋白病。表达人aSyn的转基因小鼠，特别是那些携带家族性PD突变的模型，在这方面非常有用。使用这些模型的多项研究已经确定了在富含特定类别磷脂的脑区中aSyn分布和聚集模式的改变，以及细胞中的局部扰动。例如，aSynBAC转基因小鼠模型显示aSyn基因剂量依赖性的磷酸化aSyn增加，以及突触小泡磷脂群体的特异性变化，包括年龄依赖性的神经酰胺增加和PC及PE含量减少。值得注意的是，当这种aSyn小鼠模型与GBA1杂合KO模型杂交时，在存在高量aSyn的情况下，GlcSph水平增加且GCase活性进一步降低。这一发现与aSyn抑制GCase的溶酶体运输并降低其活性，从而形成恶性双向循环的事实一致。此外，将3K-aSyn小鼠与激素敏感性脂肪酶（LIPE）杂合KO小鼠杂交改善了aSyn四聚体/单体比例和多巴胺能神经递质水平。在这种情况下，减少LIPE降低了中性脂质储存中脂肪酸的释放，从而改变了膜的磷脂组成，增加了aSyn单体的溶解度，并减少了与膜的相互作用。这些发现表明，磷脂组成及其稳态的改变可以在体内不同神经元区室（如突触和溶酶体）中调节aSyn。
在工程改造以干扰线粒体磷脂含量的模型中，干扰心磷脂稳态会在体内加剧aSyn病理。在Thy1-aSyn和MPTP小鼠模型中，酰基辅酶A溶血心磷脂酰基转移酶-1（ALCAT1）的活性增加，用高度不饱和的酰基链重塑心磷脂，促进脂质过氧化。有趣的是，ALCAT1的基因缺失或药理学阻断抑制了Ser129磷酸化的aSyn寡聚体，并挽救了黑质纹状体神经元，表明氧化的心磷脂和aSyn聚集之间存在正反馈。此外，钙非依赖性磷脂酶PLA2G6（iPLA2β）的缺失（该酶通过水解允许从受损磷脂中移除氧化的脂肪酸，作为膜重塑的一部分）导致大脑广泛的脂质过氧化，从而促进了心磷脂的氧化状态。此外，老年KO小鼠在纹状体轴突中积累内源性磷酸化aSyn，并出现轴突变性和运动衰退。在生物合成水平上，心磷脂合酶-1（Crls1）的神经元特异性KO耗尽了四亚油酰心磷脂， destabilized 呼吸复合物，并引发神经元丢失。总之，这些研究确定了病理性心磷脂重塑（通过ALCAT1的过度激活、PLA2G6修复缺陷或Crls1合成受损）是哺乳动物突触核蛋白病模型中导致线粒体功能障碍和aSyn聚集、加速神经退行性变的过程。
人类研究方面，对突触核蛋白病患者死后脑组织的相关光镜-电子显微镜结合质谱分析、三色STED纳米显微镜、相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）成像（STED-CARS）和同步辐射傅里叶变换红外分析一致表明，人类路易体（LBs）密集共沉积了膜源性磷脂，如PC、PS和鞘磷脂，并且这些脂质主要位于包涵体的内部。此外，血液和脑脊液研究一致证明，在突触核蛋白病中，磷脂代谢的紊乱远远超出大脑范围，强烈显示了它们作为生物标志物的潜力。有趣的是，死后患者脑脊液中升高的PC和PE水平与Braak分期和疾病持续时间相关。尽管所涉及的机制尚不清楚，但这些研究强烈表明，磷脂是人类路易体生物发生中的结构性和潜在致病性伙伴，因此在突触核蛋白病中扮演重要角色。
