《Plant Biotechnology Journal》：A Branched SNF1-Related Protein Kinase 2 Signalling Cascade Controls ABA-Induced Ethylene Production and Regulates Both Fruit Ripening and Reproductive Growth
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本研究首次揭示了一个分叉的SnRK2信号级联通路，通过转录（激活SlACO1）和翻译后（稳定SlACS2）双重机制调控ABA诱导的乙烯合成（AEP），阐明了ABA作为跃变型果实成熟启动信号的核心作用，并为调控果实成熟、种子发育及作物生命周期提供了新靶点。
文章内容归纳总结
1 引言
在跃变型（Climacteric, CL）果实成熟过程中，乙烯（Ethylene, ET）产量的爆发是控制成熟进程的最关键事件。尽管已知脱落酸（Abscisic Acid, ABA）能够诱导多种生物过程中的乙烯产生，但ABA诱导乙烯产生（ABA-induced Ethylene Production, AEP）的具体分子机制及其在跃变型果实成熟启动中的核心作用尚不明确。ABA作为一种胁迫信号，在果实发育过程中会因可溶性固形物积累和种子脱水等过程而积累，这提示ABA可能在跃变型果实成熟中扮演重要角色。然而，目前关于ABA调控番茄果实成熟的证据多基于药理学或转录组学分析，缺乏直接的遗传学证据。因此，本研究旨在解析调控AEP的信号转导机制，并通过遗传操作验证ABA在跃变型果实成熟中的内在作用。
2 材料与方法
本研究以番茄（Solanum lycopersicum L., Micro-Tom）为主要材料，同时考察了苹果、香蕉、芒果、木瓜和杏等典型跃变型果实。研究采用了多种分子生物学技术，包括酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid, Y2H）、双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）、体外磷酸化分析（In Vitro Phosphorylation Assays）、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）、凝胶阻滞实验（Electrophoretic Mobility-Shift Assay, EMSA）和双荧光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase Assay）。此外，通过CRISPR/Cas9技术构建了SlSnRK2.1基因敲除突变体，并通过农杆菌介导的瞬时表达和稳定转化技术研究了基因功能。
3 结果
3.1 ABA诱导的乙烯产生广泛参与跃变型果实成熟的调控
在番茄、苹果、香蕉、木瓜、芒果和杏等多种跃变型果实中，ABA的积累均早于乙烯产量的爆发。外源ABA处理显著促进了番茄果实的成熟，表现为转色加速、硬度降低和可溶性固形物含量增加，且其效果优于乙烯前体ACC。相反，ABA生物合成抑制剂NDGA则显著抑制了果实成熟。进一步研究发现，ABA处理显著上调了ABA信号转导关键组分（如SlAREB1/SlABF4）和乙烯生物合成基因（如SlACO1, SlACS2）的表达。此外，ABA处理能够显著诱导番茄果实产生乙烯，且这种诱导作用在果实成熟绿期（Mature Green, MG）最为显著。这些结果表明，AEP广泛参与并调控多种跃变型果实的成熟过程。
3.2 多个SlSnRK2s参与ABA诱导的乙烯产生
通过生物信息学分析，研究团队鉴定了8个番茄SlSnRK2s家族成员。酵母双杂交和双分子荧光互补实验证实，其中5个成员（SlSnRK2.1, SlSnRK2.3, SlSnRK2.4, SlSnRK2.6, SlSnRK2.8）能够与ABA共受体SlABI1发生物理互作。同时，凝胶阻滞实验证实HD-Zip同源盒转录因子SlHB1能够结合SlACO1启动子上的顺式作用元件。在番茄果实中瞬时过表达SlSnRK2s基因，能够显著增强ABA诱导的乙烯产生，其中SlSnRK2.1的效应最为显著。
3.3 SlSnRK2成员结合SlHB1
通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验，研究发现SlSnRK2.1、SlSnRK2.4和SlSnRK2.5能够与转录因子SlHB1发生物理互作。由于SlSnRK2.5不与SlABI1互作，后续研究主要聚焦于SlSnRK2.1和SlSnRK2.4。
3.4 SlMPK1和SlMPK2是连接SlSnRK2s与SlACS2的潜在桥梁
在拟南芥中，MAPK6（AtMPK6）能够磷酸化ACC合酶（ACS）并增强其稳定性。本研究在番茄中鉴定出两个与AtMPK6高度同源的MAPK成员（SlMPK1和SlMPK2）以及两个与AtACS2高度同源的ACS成员（SlACS2和SlACS4）。互作分析表明，5个SlSnRK2s成员（SlSnRK2.1, SlSnRK2.3, SlSnRK2.4, SlSnRK2.7, SlSnRK2.8）能够与SlMPK1和SlMPK2互作。同时，SlMPK1和SlMPK2也能够与SlACS2和SlACS4互作。这些结果提示，SlMPK1/2可能作为信号桥梁，连接上游的SlSnRK2s与下游的乙烯生物合成酶SlACS2/4。
3.5 磷酸化分析验证信号级联通路中的组分
体外磷酸化实验表明，ABA共受体SlABI1能够显著抑制SlSnRK2.1和SlSnRK2.4的自磷酸化活性。体内激酶活性分析进一步证实，ABA处理能够有效激活SlSnRK2.1和SlSnRK2.4的激酶活性。体外磷酸化实验还证实，SlSnRK2.1和SlSnRK2.4能够磷酸化SlMPK1、SlMPK2和SlHB1。此外，SlMPK1和SlMPK2能够磷酸化SlACS2，但不能磷酸化SlACS4。激酶级联激活实验表明，SlSnRK2.1能够增强SlMPK1对SlACS2的磷酸化活性。这些结果共同揭示了一个由SlSnRK2.1/2.4-SlMPK1/2-SlACS2和SlSnRK2.1/2.4-SlHB1-SlACO1组成的、分叉的磷酸化信号级联通路。
3.6 磷酸化通过翻译后稳定SlACS2和转录激活SlACO1来调控AEP
为了深入解析信号网络，研究团队对SlMPK1和SlHB1的磷酸化位点进行了分析。质谱分析鉴定出SlMPK1的6个磷酸化位点，并通过生物信息学预测了SlHB1的4个潜在磷酸化位点。体外激酶实验表明，将这些位点突变为非磷酸化形式（SlMPK16A和SlHB14A）会显著降低SlSnRK2.1对它们的磷酸化水平。相反，将SlMPK1的磷酸化位点突变为模拟磷酸化状态（SlMPK16D）则显著增强了其对SlACS2的磷酸化活性。细胞外降解实验表明，SlMPK1催化的磷酸化能够稳定SlACS2蛋白。凝胶阻滞实验显示，SlHB1的磷酸化状态影响其与SlACO1启动子的结合能力。双荧光素酶报告基因实验进一步证实，SlSnRK2.1/SlHB1信号模块能够促进SlACO1启动子的转录活性，而SlHB14A突变体则抑制了该活性。这些结果共同表明，磷酸化通过翻译后稳定SlACS2和转录激活SlACO1来协同调控ABA诱导的乙烯产生。
3.7 SlSnRK2.1调控种子发育、果实成熟和开花期
为了揭示该信号通路在植物生长发育中的广泛意义，研究团队构建了SlSnRK2.1的CRISPR/Cas9敲除突变体（CE）和过表达株系（OE）。研究发现，SlSnRK2.1-CE突变体果实成熟延迟，而SlSnRK2.1-OE株系在正常条件下对果实成熟无显著影响，但在盐胁迫条件下显著促进了果实成熟。分子机制分析表明，SlSnRK2.1-CE突变体中SlACO1的转录水平和乙烯产量显著降低，而SlSnRK2.1-OE株系中SlACS2蛋白的降解速率减慢。此外，SlSnRK2.1-CE突变体表现出完全败育的种子发育、果实硬度增加、坐果率降低以及开花期显著延长等表型。这些结果表明，SlSnRK2.1不仅调控果实成熟，还广泛参与种子发育、生殖生长和胁迫响应等多个生物学过程。
4 讨论
本研究首次揭示了一个分叉的SnRK2信号级联通路，该通路通过转录和翻译后双重机制调控ABA诱导的乙烯产生。该通路的核心组分SlSnRK2.1/2.4一方面通过磷酸化转录因子SlHB1来转录激活SlACO1的表达，另一方面通过磷酸化MAPK激酶SlMPK1/2来翻译后稳定SlACS2蛋白，从而协同促进乙烯的生物合成。这一发现阐明了ABA作为跃变型果实成熟启动信号的核心作用，并揭示了ABA与乙烯信号在调控果实成熟中的交叉对话机制。此外，SlSnRK2.1的遗传操作不仅影响了果实成熟，还导致了种子败育、开花期延长等表型，表明该信号通路在调控植物生殖生长和生命周期中具有重要作用。这些结果为通过生物技术手段调控果实成熟、改善果实品质以及控制作物生殖周期提供了新的理论依据和基因靶点。
