《Journal of Advanced Research》：Endoplasmic reticulum stress exacerbates ischemia-reperfusion-induced pulmonary endothelial barrier dysfunction by activating TXNDC5
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本研究聚焦于肺缺血再灌注损伤（LIRI）这一临床危重并发症，旨在阐明内质网应激（ERS）在其中的关键作用。研究人员发现，ERS通过激活转录因子ATF6，上调硫氧还蛋白结构域蛋白5（TXNDC5）的表达，进而破坏HSP90/eNOS复合物的稳定性，最终导致肺内皮屏障功能障碍。该研究不仅揭示了TXNDC5在LIRI中的核心致病机制，还通过临床队列验证了血浆TXNDC5作为早期诊断生物标志物的潜力，为LIRI的防治提供了新的靶点和策略。
论文解读
研究背景：肺缺血再灌注损伤的“隐形杀手”
在心脏外科手术、严重创伤或休克等临床场景中，肺缺血再灌注损伤（LIRI）是导致急性肺损伤（ALI）甚至急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的致命并发症。想象一下，当肺部的血液供应被阻断（缺血）后重新恢复（再灌注），本应是“久旱逢甘霖”的喜事，却可能引发一场剧烈的炎症风暴，导致肺血管内皮屏障（PEB）这个“守门员”功能崩溃。一旦屏障被破坏，血管内的液体和炎症细胞就会大量渗漏到肺组织间隙，形成肺水肿，最终导致患者出现严重缺氧和呼吸衰竭。
尽管科学家们已经知道氧化应激、内质网应激（ERS）和细胞凋亡等多种机制参与了LIRI的发生，但目前临床上仍缺乏能够有效干预的靶点。因此，寻找导致PEB功能障碍的“元凶”，并开发出能够早期预警和有效治疗的策略，是当前该领域亟待解决的关键科学问题。
研究思路与方法：从临床到基础，多维度验证
为了回答上述问题，研究人员开展了一项从临床到基础、从动物到细胞的多层次、系统性研究。他们首先在临床队列中发现，接受体外循环（CPB）手术并发生LIRI的患者，其血浆中一种名为硫氧还蛋白结构域蛋白5（TXNDC5）的蛋白质水平显著升高。这一发现提示，TXNDC5可能与LIRI的发生发展密切相关。
为了深入探究TXNDC5在LIRI中的具体作用，研究人员构建了经典的LIRI大鼠模型，并利用氧糖剥夺/复氧（OGD/R）处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs）来模拟体内的缺血再灌注过程。通过一系列精密的实验技术，他们系统地揭示了TXNDC5在LIRI中的致病机制。
关键实验技术概览
本研究综合运用了多种前沿技术手段，包括：
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临床队列与生物标志物分析：纳入接受体外循环手术的患者队列，通过蛋白质组学（DIA-proteomic）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆TXNDC5水平，并构建列线图（Nomogram）预测模型。
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动物模型与基因干预：建立大鼠肺缺血再灌注损伤模型，并通过气管注射腺相关病毒（AAV）介导的短发夹RNA（shRNA）技术，在体内特异性敲低TXNDC5的表达。
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细胞模型与机制探索：利用HUVECs构建OGD/R模型，通过基因过表达、小分子抑制剂（如4-PBA、Ceapin-A7）干预，并结合蛋白质印迹（Western blot）、免疫共沉淀（Co-IP）、染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）等技术，深入解析TXNDC5的上游调控机制及其下游信号通路。
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单细胞转录组测序（scRNA-seq）：对LIRI大鼠肺组织进行单细胞测序，精确解析TXNDC5在不同细胞类型中的表达谱，确认其在肺内皮细胞中的特异性高表达。
研究结果：揭示TXNDC5的“罪证”
1. 肺缺血再灌注损伤导致显著的肺内皮屏障损伤
研究人员首先证实，LIRI大鼠模型成功模拟了临床上的病理特征。与假手术组相比，LIRI组大鼠的肺组织出现了严重的炎症细胞浸润、肺泡结构破坏和间质充血。更重要的是，肺湿重/干重（W/D）比值和伊文思蓝（Evans blue）渗漏量显著增加，表明肺血管通透性增高，内皮屏障功能严重受损。透射电镜观察进一步发现，LIRI组肺内皮细胞的内质网（ER）出现肿胀，细胞间紧密连接结构被破坏，细胞凋亡率也显著升高。
2. TXNDC5在肺缺血再灌注损伤中被激活
蛋白质组学分析显示，LIRI大鼠肺组织中TXNDC5的表达水平显著上调。单细胞RNA测序结果进一步证实，TXNDC5的转录本主要富集在肺内皮细胞中，而在其他肺细胞类型中表达极低。这提示TXNDC5可能是肺内皮细胞在LIRI中特异性响应的关键分子。
3. TXNDC5通过破坏HSP90/eNOS复合物稳定性来调控内皮功能
在体外实验中，研究人员发现，在OGD/R条件下，HUVECs的TXNDC5表达升高，同时细胞活力下降、凋亡增加、屏障功能受损。而通过shRNA敲低TXNDC5后，这些损伤得到了显著缓解。机制上，TXNDC5的敲低能够恢复热休克蛋白90（HSP90）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达，并促进HSP90与eNOS之间的相互作用。环己酰亚胺（CHX）追踪实验进一步证实，敲低TXNDC5能够延长eNOS蛋白的半衰期，表明TXNDC5通过影响HSP90/eNOS复合物的稳定性来调控内皮功能。
4. TXNDC5敲低通过HSP90/eNOS复合物缓解肺缺血再灌注损伤
在动物体内实验中，研究人员通过气管注射AAV-shRNA，成功在大鼠肺组织中敲低了TXNDC5的表达。结果显示，与对照组相比，TXNDC5敲低显著减轻了LIRI引起的肺组织病理损伤、肺水肿和血管渗漏。同时，TXNDC5敲低还恢复了肺组织中HSP90和eNOS的蛋白水平，并降低了细胞凋亡率。免疫荧光染色和透射电镜观察也证实，TXNDC5敲低能够保护肺内皮细胞间的紧密连接蛋白（如VE-cadherin、ZO-1和claudin-5）的连续性和完整性。
5. TXNDC5抑制通过抑制NF-κB信号通路发挥保护作用，并与地塞米松产生协同效应
研究人员发现，LIRI能够激活核因子κB（NF-κB）信号通路，而TXNDC5的敲低则显著抑制了该通路的活化。此外，TXNDC5敲低还降低了细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达和髓过氧化物酶（MPO）的活性，表明其能够抑制白细胞与内皮细胞的黏附和浸润。有趣的是，虽然经典的抗炎药地塞米松（DEX）能够抑制NF-κB通路，但它并不影响TXNDC5的表达。而当TXNDC5敲低与DEX联合使用时，对肺内皮屏障的保护作用产生了协同增强效应，提示靶向TXNDC5可能为传统抗炎治疗提供新的增效策略。
6. 抑制内质网应激可降低TXNDC5水平并改善肺缺血再灌注损伤
既然TXNDC5是内质网应激的“产物”，那么直接抑制内质网应激能否起到保护作用呢？研究人员使用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）处理HUVECs，发现4-PBA能够剂量依赖性地降低OGD/R诱导的TXNDC5表达上调，并显著改善细胞活力、减少细胞凋亡、恢复内皮屏障功能。蛋白质印迹分析证实，4-PBA能够抑制内质网应激标志物（如BIP、ATF6、IRE1、PERK）的激活，并恢复HSP90/eNOS的表达水平。
7. 抑制ATF6通路可改善TXNDC5驱动的肺内皮屏障损伤
为了进一步明确内质网应激调控TXNDC5的具体分子机制，研究人员将目光投向了内质网应激的三个关键感受器之一——ATF6。染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）分析发现，在OGD/R处理的HUVECs中，ATF6能够直接结合到TXNDC5基因的启动子区域，从而调控其转录。功能上，使用ATF6特异性抑制剂Ceapin-A7能够显著降低TXNDC5的表达，并改善内皮细胞损伤。而当在抑制ATF6的同时过表达TXNDC5，则能够逆转Ceapin-A7的保护作用。这充分证明了ATF6-TXNDC5轴在内质网应激诱导的肺内皮屏障损伤中的核心地位。
8. 血浆TXNDC5浓度在肺缺血再灌注损伤患者中升高，并具有预测价值
最后，研究人员将目光转回临床，验证TXNDC5的转化价值。他们发现，在接受体外循环手术的患者中，发生LIRI的患者在手术结束时（T1）和术后24小时（T2）的血浆TXNDC5水平均显著高于未发生LIRI的患者。更重要的是，血浆TXNDC5水平与患者的插管时间呈正相关，与氧合指数（PaO2/FiO2）呈负相关。研究人员构建了一个包含TXNDC5水平、大量红细胞输注和体外循环时间的列线图预测模型，该模型对LIRI的预测能力（AUC）达到了0.822，显著优于仅包含临床参数的模型。这表明，TXNDC5有望成为预测LIRI发生风险的早期、敏感的生物标志物。
结论与展望：从“发现”到“转化”
本研究系统性地揭示了内质网应激在肺缺血再灌注损伤中的关键作用及其分子机制。研究人员发现，肺缺血再灌注会激活内质网应激，进而通过ATF6转录因子直接上调TXNDC5的表达。高表达的TXNDC5会破坏HSP90/eNOS复合物的稳定性，导致eNOS功能受损，最终引发肺内皮屏障功能障碍、炎症反应和细胞凋亡。
这项研究的重大意义在于，它不仅阐明了TXNDC5在LIRI中的核心致病作用，还通过临床队列验证了其作为早期诊断生物标志物的巨大潜力。这为临床医生提供了一个能够在影像学改变出现之前就识别出高危患者的工具，从而为早期干预赢得了宝贵的时间。更重要的是，该研究为开发针对TXNDC5或其上游调控分子的靶向治疗药物提供了坚实的理论基础，有望为肺缺血再灌注损伤这一临床难题带来新的治疗希望。
