《Journal of Advanced Research》：Histone H4 lysine 12 lactylation-driven ZIP14 expression is involved in electroacupuncture therapy against cerebral ischemia/reperfusion injury in mice
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本研究针对电针（EA）治疗脑缺血/再灌注损伤（CIRI）的机制尚不明确的问题，通过动物实验和临床随机对照试验，发现EA通过抑制PKM2介导的乳酸积累，降低组蛋白H4K12乳酸化（H4K12la）水平，进而抑制铁转运蛋白ZIP14的表达，最终减轻神经元铁死亡。该研究揭示了乳酸-H4K12la-ZIP14-铁死亡轴在CIRI中的关键作用，为优化EA疗法和开发新的卒中治疗策略提供了理论依据。
缺血性卒中仍是全球致死和致残的主要原因之一。当前，静脉溶栓和机械取栓是恢复血流的标准疗法，但因其出血风险高、治疗时间窗窄，仅有不足30%的患者能从中获益。更棘手的是，血管再通后的再灌注过程本身可能加重脑组织损伤，即脑缺血/再灌注损伤（Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury, CIRI），这会加速缺血半暗带内神经元的死亡。因此，深入解析CIRI的病理机制，并寻找能够挽救缺血半暗带神经元的新型辅助疗法迫在眉睫。
电针（Electroacupuncture, EA）作为传统针灸的现代发展，在临床和动物研究中均已显示出对缺血性卒中的治疗潜力。其保护机制可能涉及减轻炎症、抑制细胞焦亡、增强自噬流和突触可塑性等多个方面，然而，其根本的作用过程仍不清晰，这限制了EA疗法的优化和更广泛的临床应用。大脑作为耗氧和耗糖大户，对血流和氧气供应的突然中断极为敏感。缺血会触发细胞代谢从氧化磷酸化向糖酵解转变，导致乳酸堆积。虽有研究提示乳酸可能通过蛋白质乳酸化修饰参与调控多种生物学过程，但乳酸及其介导的组蛋白乳酸化修饰是否以及如何参与CIRI和EA的神经保护作用，仍是一个未被充分探索的领域。
为此，发表在《Journal of Advanced Research》的这项研究，旨在深入探究乳酸在EA对抗CIRI中的作用及其背后的分子机制。研究人员综合运用了行为学评估、TTC染色、蛋白质印迹（Western Blotting）、免疫荧光、染色质免疫共沉淀测序（CUT&Tag）、转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）和转录组测序（RNA-seq）等多种技术，并结合细胞实验和临床随机对照试验，系统阐述了EA通过调控乳酸代谢-H4K12la-ZIP14信号轴发挥神经保护作用的新机制。
关键技术方法
本研究的关键技术方法包括：1） 建立小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型模拟CIRI，并通过神经功能评分、TTC染色评估损伤和EA疗效；2） 利用ELISA、Western Blotting检测乳酸水平、蛋白乳酸化（如H4K12la）及PKM2、ZIP14、铁死亡标志物（GPX4, TFR1等）表达；3） 采用CUT&Tag、ATAC-seq和RNA-seq进行全基因组水平分析，筛选H4K12la调控的靶基因；4） 通过病毒介导的基因操作（如神经元特异性过表达PKM2）、药理学干预（使用PKM2激活剂ML-265、铁螯合剂DFO）验证关键分子的功能；5） 临床部分纳入计划在全身麻醉下行血管内介入治疗的卒中患者，随机分为EA组和假针刺对照组，比较再通后30分钟动脉血乳酸水平等指标。
EA alleviates CIRI and improved neurological outcomes in mice
研究发现，在MCAO/R模型小鼠中，EA预处理能显著减小脑梗死体积，改善神经功能缺损评分、旋转棒跌落潜伏期和前肢抓力，表明EA能有效缓解CIRI并改善神经功能结局。
EA reverses lactate accumulation and the elevation of H4K12la levels after CIRI
CIRI导致缺血半暗带乳酸水平显著升高，EA治疗能逆转这一现象。同时，EA能特异性抑制由CIRI引起的整体蛋白乳酸化（Pan Kla）和组蛋白H4第12位赖氨酸乳酸化（H4K12la）水平的升高，而对其他位点如H3K9la、H3K18la等影响不显著。免疫荧光共定位显示，H4K12la的升高主要发生在神经元中，并被EA治疗所逆转。
Upregulation of lactate and H4K12la diminished the neuroprotective effects of EA
CIRI后，糖酵解关键酶PKM2的表达和活性均升高，且其在细胞质和细胞核内的水平均增加，EA能抑制这种升高。RNAscope和免疫染色证实PKM2主要表达于神经元。使用PKM2激活剂ML-265（同时抑制PKM2核转位）处理EA治疗后的卒中小鼠，发现其增加了PKM2代谢活性、乳酸水平和H4K12la，并加重了脑梗死和神经功能缺损，表明PKM2的代谢活性（而非核功能）在EA保护中起主导作用。进一步通过病毒在神经元中特异性过表达PKM2，模拟了乳酸和H4K12la的升高，并发现这削弱了EA的保护效果。而特异性上调核PKM2对结局影响不大，进一步支持了代谢活性的关键作用。
Genome-wide analysis reveals an increase in H4K12la of Zip14, which increases chromatin accessibility and the transcription of Zip14
通过整合CUT&Tag（针对H4K12la）、ATAC-seq和RNA-seq数据，研究人员发现CIRI后染色质可及性增加且转录上调的基因富集在铁死亡等通路。特别值得注意的是，铁转运蛋白编码基因Zip14的启动子区域H4K12la修饰显著增加，伴随其染色质可及性增加和转录激活。这表明H4K12la通过促进Zip14基因座的开放状态来驱动其转录。
EA prevents H4K12la-mediated ZIP14 expression and ferroptosis after CIRI
Western Blotting和免疫荧光证实，CIRI后缺血半暗带ZIP14蛋白表达升高，EA能抑制其表达。CHIP-qPCR显示，在神经元中，Zip14基因位点的H4K12la富集程度远高于H3K18la。在培养的神经元细胞中过表达ZIP14会导致细胞内Fe2+和脂质过氧化产物MDA水平升高，诱导铁死亡。在体实验中，EA能逆转CIRI引起的铁死亡相关指标变化：升高谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和GPX4的表达，降低MDA水平，并改善线粒体超微结构损伤。此外，在EA治疗的卒中小鼠中注射乳酸钠（NaLa）提高H4K12la后，可逆转EA对ZIP14、TFR1表达的抑制作用，加重铁死亡和脑损伤。相反，在EA基础上联合使用铁螯合剂DFO能进一步改善结局。这些结果说明EA通过抑制H4K12la-mediated的ZIP14表达来抵抗铁死亡。
EA treatment decreases arterial lactate level after CIRI in stroke patients
临床随机对照试验结果显示，与假针刺组相比，EA组患者在血管再通后30分钟的动脉血乳酸水平显著降低，而pH值、pCO2、血糖等指标无组间差异。这提示EA能有效降低卒中患者再灌注后的乳酸积累。在动物实验中，卒中后给予EA治疗同样能下调PKM2表达、减少乳酸堆积并抑制铁死亡，表明无论是预处理还是后处理，EA都可能通过相似机制发挥保护作用。
结论与意义
本研究揭示了一条全新的EA发挥神经保护作用的信号通路：EA通过抑制神经元PKM2的活性，减少乳酸生成，进而降低组蛋白H4K12乳酸化（H4K12la）水平；H4K12la的减少削弱了其对铁转运蛋白基因Zip14的转录激活作用，导致ZIP14表达下调，最终减轻了细胞内铁超载和脂质过氧化，抑制了神经元铁死亡，从而对抗CIRI。这项工作不仅阐明了乳酸在EA疗法中的新角色，首次将乳酸代谢、组蛋白乳酸化修饰与铁死亡联系起来，为理解CIRI的病理机制提供了新视角，也为开发以乳酸-H4K12la-ZIP14-铁死亡轴为靶点的卒中治疗新策略和优化EA临床方案奠定了坚实的理论基础。研究的临床部分进一步证实了EA降低卒中患者再灌注后乳酸水平的可行性，增强了研究结果的临床转化潜力。尽管存在观察时间点单一、未能完全解析H4K12la读写酶系统、PKM2在不同细胞类型中作用可能存在异质性等局限性，但本研究无疑深化了对EA作用机制和CIRI病理生理过程的认识，具有重要的科学意义和潜在的应用价值。
