《Journal of Cereal Science》：The ultrastructure of the mature wheat grain tissue in its native state, as observed using atomic force microscopy
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本研究针对传统显微技术观察小麦籽粒超微结构易产生假象的难题，开发了一种基于超薄切片技术的AFM样品标准化制备流程，实现了对天然干燥状态（15%含水量）小麦籽粒从外果皮到淀粉胚乳的高分辨率原位表征。该研究首次发现内果皮管状细胞存在左手性螺旋扭曲特征，揭示了水合依赖性超微结构适应性，为谷物品质与加工性能的构效关系研究提供了新视角。
小麦作为全球最重要的粮食作物之一，其籽粒的微观结构直接影响磨粉品质、加工特性和营养价值。传统上，科学家们主要通过电子显微镜等技术观察小麦籽粒的超微结构。然而，这些方法通常需要对样品进行树脂包埋、脱水等复杂处理，这些处理过程很可能会改变样品的天然结构，引入人工假象，导致我们无法观察到样品在真实状态下的微观特征。特别是，对于小麦籽粒这种含水量对其结构有重要影响的材料，如何在保持其天然低水分状态（例如常见的15%含水量）下进行高分辨率成像，一直是谷物科学领域的一个技术难点。
为了解决这一难题，法国国家农业食品与环境研究院（INRAE）的Cedric Gaillard在《Journal of Cereal Science》上发表了一项创新研究，开发了一种基于原子力显微镜（AFM）的新型样品制备和表征方法，成功实现了对天然状态成熟小麦籽粒组织超微结构的原位、高分辨率观察。这项研究不仅建立了一套标准化的样品制备流程，更重要的是揭示了在传统方法中可能被掩盖的关键结构特征。
为开展本研究，作者采用了几个关键技术方法：首先，使用定制化样品台实现超薄切片与AFM扫描的精准对接，确保样品表面与探针扫描面严格平行；其次，对天然干燥小麦籽粒（品种为Recital，含水量约15%）进行直接切割，通过玻璃刀修整和钻石刀超薄切片序列获得光滑表面；最后，利用轻敲模式AFM在空气中对样品进行扫描，采用低扫描力（<10 nN）以最小化样品变形，获得高度、误差信号和相位对比图像。
3.1. 平滑处理的天然小麦样品表面粗糙度
研究人员首先量化了样品表面的粗糙度参数（均方根粗糙度和平均粗糙度）。结果显示，天然小麦样品在麸皮区域的粗糙度值虽然高于树脂包埋样品，但仍能满足AFM高分辨率成像的要求，相对粗糙度低于图像宽度的2%，保证了成像可靠性。
3.2. 基于AFM成像的天然样品超微结构
AFM图像清晰揭示了天然状态小麦籽粒各层结构的细节：外层（果皮、种皮和珠心表皮）在干燥状态下呈现紧凑、连续的结构，层间粘附力更强。最引人注目的发现是内果皮管状细胞层存在此前未被描述的左手性螺旋扭曲，这种特征在传统的树脂包埋技术中可能会丢失。种皮表现为一层薄而连续的带状结构，紧密粘附在管状细胞的内侧。
3.3. 树脂包埋水合样品与干燥天然样品中MEA和内果皮超微结构的比较
通过对比树脂包埋的水合样品与干燥天然样品，研究发现水合状态下果皮层之间更容易滑动分离，而干燥状态下则形成更紧凑的结构。管状细胞层的螺旋扭曲在天然干燥样品中更为明显，扭曲周期约为12.5μm。此外，天然样品中的糊粉层细胞壁和珠心表皮呈现更光滑、致密的形态，而非树脂包埋样品中可见的纤维状结构。
4.1. 样品制备途径
本研究发展的干切成熟籽粒方法避免了树脂包埋，保留了样品的天然状态。定制化设备确保了样品表面与AFM扫描面的严格平行，是实现大范围平坦组织表面AFM成像的关键。
4.2. 外果皮和内果皮
干燥天然样品中果皮层呈现紧凑结构，层间粘附力强。管状细胞的螺旋扭曲特征被认为是细胞-细胞粘附将分子水平的应力冲突转化为组织水平宏观排列的结果。这种结构特征在传统样品制备方法中因细胞间粘接触点受损而丢失。
4.3. 种皮和珠心表皮
在天然样品中，种皮表现为约400纳米厚的疏水层，紧密粘附在管状细胞层内侧。珠心表皮是中间层中最厚的非木质化层，估计厚度为4.2μm，在成熟状态呈现复杂结构。
4.4. 糊粉细胞
AFM成功解析了糊粉层的关键超微结构特征：细胞壁的多糖纤维、糊粉腔内的致密基质以及明显的包含物——富含矿质的球状体（I型）和三酰甘油滴（II型）。高分辨率AFM成像进一步揭示了I型包含物的复杂结构：植酸盐基矿物纳米颗粒嵌入球形蛋白质基质中，整个结构被脂滴分布所包围。
4.5. 亚糊粉区与淀粉胚乳结构
研究观察到亚糊粉层和外围胚乳细胞作为糊粉层与淀粉胚乳区的中间层。淀粉胚乳区呈现多种尺寸的卵形淀粉颗粒分布，每个颗粒嵌入连续的谷蛋白基质中。在天然干燥样品中，淀粉颗粒内部仅观察到光滑连续表面，而非树脂包埋水合样品中可见的周期性生长环，证实了水合作用在揭示淀粉颗粒亚结构中的重要性。
这项研究建立了一种基于原子力显微镜的可靠方法，用于天然状态成熟小麦籽粒的高分辨率超微结构分析。通过避免树脂包埋，开发的方案保留了组织的天然状态，揭示了传统制备方法可能改变或掩盖的独特结构特征。管状细胞螺旋扭曲的发现证明了样品制备对观察形态的显著影响，强调了在尽可能接近天然状态下研究样品的重要性。对天然小麦籽粒各层结构的详细纳米级描述，从紧凑的外果皮到糊粉细胞内的复合包含物，是对先前超微结构分析的有价值补充。这项工作为 advanced 相关研究（如将AFM与纳米压痕和拉曼光谱相结合）铺平了道路，以增进对谷物品质和功能性的理解。
