ROS放大型纳米调节剂：通过精确靶向硫氧还蛋白还原酶来破坏氧化还原平衡，从而克服肿瘤的氧化还原抵抗性

《Journal of Controlled Release》：ROS-amplifying nanoregulators: Precision thioredoxin reductase-targeted disruption of redox homeostasis overcomes tumor redox resistance

恶性肿瘤常通过代谢重编程和强化抗氧化机制产生氧化应激治疗耐药性。本研究设计并合成一种新型纳米调节剂P-3@MIL-100@HA（PMH），通过抑制TrxR、铁基金属有机框架（MIL-100）释放Fe2?及HA介导的CD44靶向递送，三重阻断肿瘤抗氧化防御：1）P-3抑制TrxR导致H?O?累积；2）Fe2?催化Fenton反应产·OH并耗竭GSH；3）HA涂层实现肿瘤特异性递送。在胃癌模型中，PMH通过氧化应激放大和抗氧化通路抑制协同诱导凋亡和炎症小体激活，疗效优于传统疗法且系统毒性低。本研究首次实现TrxR抑制与金属有机框架化疗动力学的整合，为克服肿瘤氧化应激耐药提供新策略。

　　

卢 Ga|辛友涛|刘洪宇|张启峰|宁伟|王新燕|于云健|苏美慧|高慧

国家分离膜与膜过程重点实验室&中空纤维膜材料与膜过程重点实验室（教育部）&天津工业大学材料科学与工程学院中空纤维膜材料与过程重点实验室，天津300387，中国

摘要

恶性肿瘤常常通过代谢重编程和增强氧化还原防御机制来对抗氧化应激疗法。为了克服这一挑战，我们策略性地针对了硫氧还蛋白还原酶（TrxR），这是一种细胞氧化还原稳态的主要调节因子。我们评估了TrxR的破坏是否能够削弱肿瘤的抗氧化能力并恢复其对治疗的敏感性。我们设计了一种肿瘤选择性纳米调节剂P-3@MIL-100@HA（PMH），它结合了天然产物衍生的TrxR抑制剂（P-3）和基于铁的金属有机框架（MIL-100），并涂有透明质酸（HA）以实现通过CD44介导的递送。核心成分P-3通过系统的药理学筛选和结构优化被鉴定为一种有前景的TrxR抑制剂。PMH在耐药肿瘤中通过以下三种方式破坏氧化还原平衡：（1）P-3有效抑制TrxR，导致过氧化氢积累，加剧氧化应激；（2）通过铁介导的氧化还原循环耗尽GSH，削弱抗氧化防御；（3）芬顿反应产生的羟基自由基（·OH）进一步加剧氧化损伤。在还原性的肿瘤微环境中，PMH表现出对刺激的响应性，释放P-3和Fe²⁺，触发双重凋亡和焦亡。在胃癌模型中，PMH表现出优异的治疗效果，并且全身毒性极低。本研究首次成功地将TrxR抑制与基于金属的化学动力学疗法（CDT）相结合，建立了氧化应激介导的抗癌治疗的新范式。我们的工作为开发增强氧化应激的纳米治疗剂提供了基本的设计原则，并提出了一种针对氧化应激耐药性恶性肿瘤的临床可行策略。

引言

活性氧（ROS）在各种细胞过程中起着关键作用，包括代谢、分化、增殖和信号通路[1,2]。为了维持快速增殖，癌细胞表现出异常的代谢，导致ROS的产生量高于正常细胞[3]。然而，ROS的产生与清除之间的不平衡会引发氧化应激，损害细胞成分并导致病理状态[1,3]。为了对抗这一点，恶性细胞上调了关键的抗氧化蛋白，包括硫氧还蛋白还原酶（TrxR），从而建立了强大的防御系统，增强了对抗氧化损伤的能力。这种适应性机制使恶性细胞能够在高ROS条件下存活并发展出治疗抵抗性。当氧化应激诱导不足时，这种氧化还原适应使得肿瘤对氧化应激介导的疗法的敏感性降低[3,4]。

作为一种代表性的氧化应激介导的肿瘤疗法，化学动力学疗法（CDT）利用芬顿/类芬顿反应将内源性过氧化氢（H₂O₂）转化为肿瘤微环境中的细胞毒性羟基自由基（·OH），具有高肿瘤特异性和最小的脱靶效应[[5], [6], [7]]。然而，其效果受到肿瘤内H₂O₂水平不足和癌细胞强氧化还原稳态的严重限制[8]。为了解决这个问题，最近的研究集中在增加H₂O₂的供应和消耗谷胱甘肽（GSH）以增强CDT[9]。尽管将多种治疗策略整合到单一纳米平台上是一种有前景的方法，但现有系统面临一个根本的限制：肿瘤细胞通过内在的ROS自我调节机制积极对抗氧化应激，导致H₂O₂的产生短暂且不足。这一固有的生物学限制突显了开发能够实现全面和持续氧化应激调节的纳米治疗剂的迫切需求，这是优化针对氧化应激耐药性恶性肿瘤的CDT效果的关键。

在抗氧化防御系统中，硫氧还蛋白系统（硫氧还蛋白还原酶/硫氧还蛋白，TrxR/Trx）由TrxR、硫氧还蛋白（Trx）和NADPH组成，是细胞内氧化还原稳态的主要调节因子。这个三元复合体共同维持细胞氧化和还原之间的关键平衡[4,7,8]。TrxR/Trx系统通过还原氧化的大分子并间接清除ROS（通过过氧化还原蛋白（Prx）来减轻氧化损伤[7]。还原的Trx催化氧化的Prx中的二硫键（S-S）的还原，同时自身被氧化。然后TrxR使用NADPH再生还原的Trx。同时，Prx通过将其转化为水来解毒H₂O₂，而其自身的氧化半胱氨酸残基通过Trx介导的还原得到恢复。值得注意的是，肿瘤利用这一系统来对抗其内在升高的ROS水平并逃避氧化损伤。除了氧化还原控制外，TrxR/Trx系统还调节增殖和新生血管形成，使肿瘤能够持续生长并优化营养/氧气供应[[10], [11], [12], [13], [14]]。鉴于其在肿瘤存活和进展中的核心作用，TrxR/Trx系统成为氧化应激依赖性疗法的有希望的目标[6,15]。

天然产物由于其出色的生物相容性和进化精炼的生物活性，成为开发新型生物活性分子的理想结构支架。这些特性使它们特别适合设计TrxR抑制剂，因为它们的复杂药效团可以有效地靶向酶的独特硒半胱氨酸活性位点，同时保持有利的药理学特性[16,17]。姜黄素是从姜黄（Curcuma longa）根中提取的黄色亲脂化合物，是最早和最广泛研究的天然TrxR抑制剂之一[18,19]。通过抑制TrxR，姜黄素增加细胞内的氧化应激，触发ROS积累、DNA损伤，最终导致凋亡[20]。鸢尾醌是鸢尾籽的主要生物活性成分，由于其多样的药理特性而引起了大量研究兴趣[[21], [22], [23]]。我们最近的研究表明，鸢尾醌作为一种有效的TrxR抑制剂，在癌细胞中有效诱导氧化应激介导的凋亡和焦亡[24]。结构相关的天然化合物，如姜辣素和紫堇素，也表现出TrxR抑制活性，扩展了用于开发氧化还原调节抗癌剂的天然产物类别。这些发现突显了天然产物衍生的TrxR抑制剂作为氧化应激依赖性化疗（CT）的强大剂的潜力，并且是增强CDT的理想伴侣。尽管近年来有几项研究报道了天然TrxR抑制剂的生物学评估[[16], [17], [18], [19], [20],24]，但迄今为止，开发具有高肿瘤特异性和敏感性的智能TrxR抑制剂的工作仍然大部分未得到探索。

除了硫氧还蛋白系统外，谷胱甘肽途径（GSH/GPX4）是另一种重要的抗氧化防御机制。这两个系统共同维持细胞内的氧化还原稳态并保护细胞免受氧化应激[3,25]。然而，单独针对任一系统都显示出有限的治疗效果，因为这些途径之间存在补偿性的交叉激活[[17], [18], [19], [20],26,27]。

基于天然产物支架，我们保留了α,β-不饱和酮基团作为迈克尔受体，并通过对鸢尾醌、姜黄素等化合物进行合理的结构优化，设计了两个化合物系列。通过系统的药理学筛选和结构优化，P-3被鉴定为一种有效的TrxR抑制剂，能够有效破坏肿瘤的氧化还原稳态（图1和表1）。随后，我们设计了一种新型的氧化应激纳米调节剂P-3@MIL-100@HA（PMH），通过将P-3封装在基于铁的金属有机框架（MIL-100）中，并用透明质酸（HA）涂层，后者是多种癌细胞中过表达的CD44受体的配体[[28], [29], [30]]。这种设计通过氧化应激敏感化、氧化还原增强和补偿性抗氧化途径抑制来实现全面的氧化还原稳态破坏（方案1）。纳米调节剂PMH通过GSH响应性的MIL-100降解和Fe³⁺还原为Fe²⁺来表现出肿瘤特异性激活，从而实现P-3的受控释放。这种三重机制通过以下方式实现完全的氧化还原失调：（1）TrxR阻断并诱导H₂O₂积累；（2）GSH清除并削弱氧化应激防御；（3）·OH爆发并加剧氧化应激，最终在胃癌模型中诱导凋亡和焦亡，同时全身毒性极低。

通过同时破坏两个关键的氧化还原调节系统，TrxR和GSH途径，PMH选择性地使肿瘤细胞对ROS介导的细胞毒性敏感，而正常细胞由于其较低的抗氧化需求而免受影响。这种策略为氧化应激依赖的CT和CDT实现了协同治疗效果：（1）有效提高氧化应激至治疗水平；（2）系统性地破坏过度的抗氧化防御。这些行动共同建立了一种克服氧化应激介导的癌症疗法基本限制的新范式。

材料

本研究中使用的所有试剂和化学品均为商业购买。以下材料来自中国上海的Beyotime：CCK-8试剂盒（BS350C）、胰酶（BL501A）、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（C1062S）、活性氧检测试剂盒（DCFH-DA, S0033S）、羟基自由基检测试剂盒（HPF, BB24111）、硫氧还蛋白还原酶检测试剂盒（Fast-TRFS, HY-D1252）、过氧化氢检测试剂盒（Amplex Red, BL930A）、谷胱甘肽检测试剂盒（MCB, 3091403）

TrxR抑制剂作为抗癌剂的合成与评估

结构研究表明，大多数已知的TrxR抑制剂作为迈克尔受体亲电试剂，能够共价修饰TrxR灵活C末端的SEC-498残基[16,17,20,26,53]。基于这一明确的机制，我们假设2-甲氧基-1,4-二苯醌（Q-0），即鸢尾醌的核心迈克尔受体药效团（图中红色标出的顺式烯烃侧链缺失的形式），是关键的结构决定因素

结论

总之，本研究介绍了一种创新的氧化应激纳米调节剂（PMH），它是通过将结构优化的TrxR抑制剂（P-3）战略性地整合到基于铁的金属有机框架（MIL-100）和HA涂层中而开发的。新型TrxR抑制剂P-3是通过天然产物姜黄素、鸢尾醌等的结构引导优化工程化得到的，具有增强的目标选择性（SI高达19.4）和显著的生物活性（IC₅₀ = 1.51–12.81 μg/mL）。

CRediT作者贡献声明

卢 Ga：撰写——原始草稿、方法学、资金获取。辛友涛：可视化、方法学、正式分析、数据管理。刘洪宇：可视化、软件、方法学。张启峰：方法学、正式分析、数据管理。宁伟：方法学、正式分析、数据管理。王新燕：方法学、正式分析、数据管理。于云健：撰写——审稿与编辑、方法学。苏美慧：撰写——原始草稿、方法学、研究、资金获取

未引用参考文献

[78], [79], [80]

利益冲突声明

作者声明没有竞争性财务利益。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（22201207, 82160652, U20A20260, 22075209）、内蒙古自然科学基金（2023LHMS08020）、内蒙古医科大学重点项目（YKD2022ZD017）、内蒙古医科大学2024-2026年人才项目（ZY20241203）、国家重点研发计划（2024YFE0104000）、天津市自然科学基金重点项目（22JCZDJC00570）的支持