《Journal of Controlled Release》：Antigen-conjugated scaffolds enable sustained delivery of antigen and enrichment of antigen-specific T-cells
编辑推荐：
本研究针对抗原特异性T细胞体内富集与表型维持的难题，开发了一种新型抗原偶联支架。通过将抗原共价偶联至PLG聚合物骨架，实现了抗原的精确装载与持续释放。实验证实，该支架能有效招募并富集抗原特异性CD4 T细胞，且避免了T细胞过度活化与耗竭，为免疫学研究及疾病诊断提供了有力工具。
在免疫学研究的广阔天地中，T细胞扮演着至关重要的角色，它们如同身体的“特种部队”，能够精准识别并清除病原体或异常细胞。然而，这些“特种部队”中的精英——即针对特定抗原的T细胞克隆，在血液中极为稀少，通常每10万个细胞中才有一个。这种稀有性使得科学家们难以直接研究它们，往往需要通过体外扩增来获得足够的细胞数量。但体外扩增过程不仅耗时费力，还常常会改变细胞的天然状态和功能，导致研究结果失真。
为了克服这一瓶颈，研究人员将目光投向了生物材料。当一种材料被植入体内时，身体会启动“异物反应”，招募大量的免疫细胞聚集在材料周围，形成一个“免疫生态位”。这个生态位就像是一个天然的“细胞聚集地”，为研究免疫细胞提供了便利。然而，这个生态位主要由先天免疫细胞构成，对于后天免疫的“主力军”——T细胞，特别是那些针对特定抗原的T细胞，吸引力有限。
为了将特定的T细胞“引诱”到这个生态位中，研究人员尝试在材料中装载抗原。但传统的装载方法，如物理吸附或包埋，存在诸多问题：抗原装载量难以精确控制，释放过程往往是“爆发式”的，导致局部抗原浓度过高，反而可能引起T细胞的过度活化、耗竭甚至死亡。这就像用一把霰弹枪打靶，不仅难以命中目标，还可能伤及无辜。
为了解决这些问题，来自密歇根大学的研究团队在《Journal of Controlled Release》上发表了一项研究，他们开发了一种名为“抗原偶联支架”的新技术。这项技术的核心在于，他们不再是将抗原简单地“塞”进材料里，而是通过化学方法，将抗原分子像“挂件”一样，牢固地连接在构成支架的聚合物骨架上。这种方法不仅实现了抗原装载量的精确控制，还确保了抗原能够随着材料的缓慢降解而持续、稳定地释放，从而为T细胞提供一个温和而持久的刺激环境。
关键技术方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：
- 1.
抗原偶联支架的构建：利用碳二亚胺交联化学，将卵清蛋白（OVA）或多发性硬化症相关自身抗原（PLP139–151）肽段共价偶联到聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLG）骨架上，通过溶剂浇铸和盐沥滤技术制备出多孔支架。
- 2.
体外释放与活性验证：通过CBQCA蛋白定量试剂盒检测抗原释放动力学；利用A20 B细胞和DO-11.10 T细胞系共培养模型，通过IL-2 ELISA检测抗原特异性T细胞活化。
- 3.
体内细胞募集与富集：采用OT-II转基因小鼠（OVA特异性T细胞受体）或GFP小鼠（绿色荧光蛋白标记）来源的脾细胞进行过继转移，将支架植入C57BL/6J小鼠皮下，7天后通过流式细胞术和组织学分析评估细胞浸润和富集情况。
- 4.
细胞表型分析：通过流式细胞术对支架中募集的细胞进行分型，包括巨噬细胞、树突状细胞、CD4 T细胞亚群（Th1, Th2, Th17, Treg）以及T细胞耗竭标志物（PD-1, TIM-3, LAG-3）的表达。
研究结果
1. 成功构建了可精确调控抗原装载量的支架
研究人员首先利用碳二亚胺交联化学，成功地将多种OVA肽段（如OVA257–264、OVA321–339和OVA323–339）共价偶联到PLG聚合物上，偶联效率高达72%至97%。通过将偶联了抗原的聚合物与未偶联的聚合物按不同比例混合，他们能够精确地控制支架中抗原的最终浓度，从而构建出从低剂量（0.04 μg/mg PLG）到高剂量（40 μg/mg PLG）的一系列支架。
2. 支架实现了抗原的持续释放并保留了生物活性
体外释放实验表明，这种化学偶联的方法能够实现抗原的持续释放，在长达三周的时间内，释放的抗原总量不到装载量的10%，有效避免了传统方法中常见的“爆发式释放”。更重要的是，从支架中释放出来的抗原能够被抗原呈递细胞（APC）摄取、加工并呈递给T细胞，从而激活抗原特异性T细胞，并诱导其分泌白细胞介素-2（IL-2），证明了释放的抗原具有完整的生物活性。
3. 支架在体内外均能有效富集抗原特异性T细胞
在体外实验中，当将抗原特异性T细胞与支架共培养时，研究人员观察到了剂量依赖性的T细胞活化（IL-2分泌增加）和增殖。在体内实验中，他们将OVA特异性T细胞过继转移到健康小鼠体内，然后植入不同剂量的抗原偶联支架。结果发现，与空白支架相比，含有OVA抗原的支架能够显著富集抗原特异性CD4 T细胞。有趣的是，这种富集效应呈现出复杂的剂量依赖性：在中等剂量（4 μg/mg和20 μg/mg）下富集效果最好，而在最高剂量（40 μg/mg）下富集效果反而下降，这提示过高的抗原浓度可能导致了T细胞的过度活化或耗竭。
4. 支架避免了T细胞的过度耗竭
为了评估支架对T细胞状态的影响，研究人员对支架中募集的T细胞进行了详细的表型分析。他们发现，与空白支架相比，抗原偶联支架中的T细胞并没有表现出更高的耗竭标志物（如PD-1, TIM-3, LAG-3）表达水平。这表明，这种持续、可控的抗原递送方式能够有效激活T细胞，同时避免了因过度刺激而导致的T细胞功能衰竭。
5. 平台具有模块化特性，可应用于自身免疫病研究
为了证明该平台的通用性，研究人员将其应用于多发性硬化症（MS）的研究中。他们构建了装载有MS自身抗原PLP139–151的支架。体外实验证实，这些支架同样能够激活PLP特异性的T细胞。这证明了该技术平台不仅适用于模型抗原，也适用于疾病相关的自身抗原，为研究自身免疫病中T细胞的功能提供了新的工具。
研究结论与意义
本研究成功开发了一种新型的抗原偶联支架平台，通过将抗原共价偶联于聚合物骨架，实现了抗原的精确装载与持续释放。该平台在体内外均能有效富集抗原特异性CD4 T细胞，且避免了T细胞的过度耗竭。更重要的是，该技术具有高度的模块化特性，可轻松应用于不同疾病相关抗原的研究。
这项研究的成功，为免疫学研究开辟了新的道路。它提供了一种强大的工具，能够在不改变细胞天然状态的情况下，从体内“捕获”并研究那些稀有的、具有重要功能的T细胞。这不仅有助于我们更深入地理解T细胞在健康与疾病中的作用，也为开发新的免疫疗法和诊断方法奠定了坚实的基础。未来，这种技术有望用于监测疾病的发生发展、评估治疗效果，甚至可能作为一种局部免疫调节工具，在肿瘤、自身免疫病等领域发挥重要作用。
