《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》：Reproducible Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry–Based Top-Down Proteomics of Complex Proteomes Enabled by an Advanced Cationic Polymer Coating
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本文报道了一种改进的阳离子聚合物涂层（APTAC）制备方法，通过使用AIBN引发剂和甲醇溶剂，显著提升了毛细管电泳-质谱联用（CZE-MS）技术在自上而下蛋白质组学（TDP）分析中的可重复性和易用性。该技术在不同实验室成员间展现出优异的涂层制备重现性，并在纳米颗粒蛋白冠、组蛋白及大肠杆菌裂解液等复杂生物样本中，实现了对蛋白质形态（proteoform）分离谱图、迁移时间（MT）及信号强度的长期稳定测量（35次连续运行，RSD<2.1%），为大规模TDP研究提供了可靠的技术平台。
1 引言
在基于质谱（MS）的自上而下蛋白质组学（TDP）研究中，毛细管区带电泳-质谱联用（CZE-MS）已成为一种强大的技术，能够根据蛋白质形态（proteoform）的荷质比进行高效分离，并实现高灵敏度的检测。然而，蛋白质在毛细管内壁的吸附是限制CZE-MS分辨率和重现性的主要因素。为了最大限度地减少非特异性吸附，毛细管内壁通常需要涂覆聚合物涂层。
阳离子聚合物涂层通过在毛细管内表面形成带正电的层，排斥在典型CZE-MS条件下通常带正电的蛋白质形态，从而减少吸附并增强分离。聚（丙烯酰胺-co-（3-丙烯酰胺丙基）三甲基氯化铵）（PAMAPTAC）涂层是一种新型的阳离子涂层，在复杂生物样本的TDP分析中显示出巨大潜力。然而，之前的涂层制备方法在重现性方面存在挑战。本研究旨在改进阳离子涂层的制备程序，并评估其在多种复杂生物样本分析中的长期重现性。
2 实验部分
2.1 材料与化学品
实验使用聚酰亚胺涂层的熔融石英毛细管（内径50 μm，外径360 μm）。主要化学品包括单体（3-丙烯酰胺丙基）三甲基氯化铵（APTAC）、聚合引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）、45%氢氟酸（HF）以及LC/MS级甲醇、水和乙酸。样本包括标准蛋白混合物（牛血清白蛋白、碳酸酐酶、肌红蛋白和泛素）、小牛胸腺组蛋白提取物、纳米颗粒蛋白冠样本以及大肠杆菌（Escherichia coli）细胞裂解液。
2.2 样本制备与缓冲液置换
标准蛋白混合物在5%乙酸（pH 2.4）的背景电解质（BGE）溶液中配制。组蛋白样本溶解于水中。纳米颗粒蛋白冠样本通过将磁性颗粒与人血浆孵育形成，随后使用SDS溶液洗脱，并通过10 kDa截留分子量的Amicon超滤离心管进行缓冲液置换至5%乙酸中。大肠杆菌细胞裂解液同样通过Amicon超滤离心管进行缓冲液置换，依次使用50 mM碳酸氢铵（ABC）、水和5%乙酸进行清洗，最终溶解于5%乙酸中。
2.3 毛细管制备
裸熔融石英毛细管（1米长）依次用1 M盐酸、水、1 M氢氧化钠、水和甲醇冲洗，并在氮气下干燥。随后，毛细管用50% 3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯的甲醇溶液进行硅烷化处理，并在室温下孵育1天。孵育后，毛细管用甲醇冲洗并干燥。
将APTAC单体溶解于甲醇中，加入AIBN引发剂，并在氮气下脱气。将预处理过的毛细管用真空泵充满该脱气溶液，密封后在40°C下孵育1小时。孵育后，毛细管用水冲洗以去除多余的单体溶液。为了减小涂层毛细管的外径以便于CZE-MS接口安装，毛细管一端用45%氢氟酸蚀刻70分钟。
2.4 CZE-MS分析
CZE分离使用Agilent 7100 CE系统，通过电渗泵纳升电喷雾接口（EMASS-II）与Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF质谱仪联用。鞘液为含10%甲醇和0.2%甲酸的水溶液。电喷雾电压为+2.2至+2.5 kV。CZE分离在-30 kV电压下进行，使用5%乙酸作为BGE和样本缓冲液。每次运行后，毛细管在-30 kV电压下用BGE冲洗20分钟。
3 结果与讨论
3.1 阳离子涂层在不同实验室成员间的重现性
为了验证改进后的涂层制备方法的可重复性，三名实验室成员（包括一名高中学生）分别制备了阳离子涂层毛细管。使用标准蛋白混合物（碳酸酐酶、肌红蛋白、泛素和牛血清白蛋白）对三根毛细管进行三重分析。结果显示，三名成员制备的毛细管分离谱图高度一致。在未进行迁移时间（MT）校正的情况下，蛋白质的MT相对标准偏差（RSD）小于9%；以泛素峰为参考进行简单MT校正后，RSD降至小于2%。蛋白质形态强度的RSD在2%至24%之间。这些结果表明，该阳离子涂层制备方法具有高度的重现性，易于推广。
3.2 阳离子涂层CZE-MS在复杂蛋白质形态混合物中的评估
3.2.1 纳米颗粒蛋白冠样本
对蛋白冠样本进行了五次重复分析。CZE-MS产生了约20分钟的有效分离窗口，能够清晰检测到分子量约为3.1 kDa和10.1 kDa的蛋白质形态。五次运行中，3.1 kDa蛋白质形态的MT RSD为1.39%，强度RSD为8.36%；10.1 kDa蛋白质形态的MT RSD为1.83%，强度RSD为7.17%。结果表明，APTAC涂层毛细管CZE-MS在蛋白冠样本分析中具有高度的一致性和重现性。
3.2.2 组蛋白样本
对商业组蛋白样本进行了分析。与线性聚丙烯酰胺（LPA）涂层相比，APTAC涂层由于电渗流（EOF）方向反转，导致组蛋白的迁移顺序发生反转。H2B/H2A迁移时间最短，其次是H4、H3，H1迁移时间最长。APTAC涂层实现了约12分钟的分离窗口，优于LPA涂层的约6分钟，有利于提高分辨率和串联质谱（MS/MS）分析效率。18次CZE-MS运行结果显示，分离谱图高度重现，所有组蛋白的MT和强度RSD分别小于10%和12%。
3.2.3 大肠杆菌细胞裂解液样本
为了评估系统的长期重现性，对大肠杆菌裂解液样本进行了35次连续运行（约40小时）。选择了三个分子量在26至34.6 kDa之间的大蛋白质形态进行详细评估。结果显示，35次运行的蛋白质形态谱图高度一致。在未进行MT校正的情况下，三个大蛋白质形态的MT RSD小于6.5%；以最丰富的峰为基准进行MT校正后，RSD降至小于2.1%。蛋白质形态强度的RSD在20.9%至32.8%之间，对于大规模蛋白质形态研究而言，定量重现性在合理范围内。这些大蛋白质形态的理论塔板数（N）约为5000，低于LPA涂层毛细管的数据，这主要是由于在阳离子涂层CZE-MS分析中未进行在线样本堆积所致。
4 结论
本研究开发了一种改进的APTAC阳离子毛细管涂层制备方法，该方法的可重复性得到了不同实验室成员的验证。CZE-MS技术在蛋白冠、组蛋白和大肠杆菌细胞裂解液等多种复杂生物系统中，均表现出对蛋白质形态的高度重现性测量。该技术在大规模TDP研究中展现出巨大潜力。未来的改进方向包括研究在线样本堆积技术以增强检测灵敏度，并推动该技术在更广泛的研究群体中的应用。
