《Laboratory Investigation》：Comprehensive Spatial Methods (CSM): A Toolbox for Spatially Analyzing Tissues in Histopathology
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本研究通过免疫组化分析Integrin α3在64例儿童肾病综合征患者中的表达，建立半定量Int评分系统，发现FSGS患者中Integrin α3显著高表达（73.08% vs 19.44%），与蛋白尿、eGFR下降相关，并成功将7例MCD患者重新分类为高风险组，证实Int评分可作为区分FSGS/MCD及预测进展的生物标志物。
作者：胡友（Hui You）、王国（Kuo Wang）、张明书（Mingshu Zhang）、杨海平（Haiping Yang）、杨学军（Xuejun Yang）、陈亚曦（Yaxi Chen）、王莫（Mo Wang）、张高富（Gaofu Zhang）、岳淑玲（Shuling Yue）、徐平勇（Pingyong Xu）、邱莉（Qiu Li）
单位：重庆医科大学儿童医院肾脏科、国家儿童健康与疾病临床研究中心、教育部儿童发育与疾病重点实验室、重庆市儿科代谢与炎症疾病重点实验室，中国重庆 400014
摘要
由于缺乏可靠的生物标志物，原发性局灶性节段性肾小球硬化症（FSGS）的诊断仍然具有挑战性。本研究探讨了整合素α3作为诊断生物标志物的潜力，以区分FSGS和微小病变肾病（MCD），并预测MCD患者的病情进展风险。研究分析了64名特发性肾病综合征（INS）患者的肾活检样本，其中36例为MCD，28例为FSGS。通过免疫组化方法使用新型半定量评分系统（Int评分：0-3）评估整合素α3的表达和分布。使用皮尔逊相关系数（Pearson’s correlation）分析临床相关性。接收者操作特征（ROC）曲线分析评估了Int评分的诊断价值，并确定了区分有FSGS进展风险的MCD患者的临界值。研究发现，FSGS肾小球病变周围区域的整合素α3显著上调，与 Annexin A3、Claudin-1 和 CD44 共定位。FSGS病例中整合素α3的局灶性过表达率为73.08%，而MCD病例中仅为19.44%。在MCD中，60.62%的肾小球Int评分为0，而FSGS病例中74.36%的肾小球Int评分≥1。ROC曲线分析显示Int评分具有很强的区分能力（AUC = 0.91）。Int评分与足细胞损伤、24小时蛋白尿和节段性硬化肾小球的比例呈正相关，与血清白蛋白和估算的肾小球滤过率（eGFR）呈负相关。根据Int评分，7名MCD患者被分为高FSGS风险组，这些患者与其他MCD患者相比，足突宽度更宽，蛋白尿持续时间更长。总体而言，表达整合素α3的肾小球壁上皮细胞（PECs）侵入肾小球丛，促进了硬化病变的发展。整合素α3的表达模式可作为组织病理学生物标志物，用于区分FSGS和MCD，识别最初被误诊为MCD的患者，从而实现早期干预和个性化监测。
引言
微小病变肾病（MCD）和原发性局灶性节段性肾小球硬化症（FSGS）是特发性肾病综合征（INS）的不同组织病理亚型[1]，后者是儿童群体中常见的慢性肾脏疾病[2]。MCD占INS病例的大多数[2, 3, 4]，通常对类固醇治疗反应良好[5, 6]，而部分FSGS患者的预后较差，尤其是对皮质类固醇治疗抵抗的患者，需要使用非甾体免疫抑制剂[7, 8]。FSGS通常需要更积极的治疗措施以防止进展为终末期肾病（ESRD）[9, 10, 11, 12]。此外，FSGS的复发率较高[12, 13]，这突显了早期和准确诊断对有效长期管理患者的重要性。与其他肾脏病理如膜性肾病[14]和弥漫性系膜硬化[15]相比，临床实践中区分FSGS和MCD具有显著挑战性。当可用于组织病理学评估的肾小球数量有限时，病理学家可能无法排除存在微小硬化病变的可能性，从而增加将FSGS误分类为MCD的风险[16, 17]。这一问题在儿童病例中尤为突出，因为这些患者对类固醇治疗具有抵抗性。FSGS的诊断依赖于识别局灶性硬化病变[17, 18]。早期和准确的诊断可以及时使用非甾体免疫抑制剂进行干预，从而减少类固醇使用的副作用，并有效延缓FSGS的进展。
区分MCD和FSGS的研究重点关注与FSGS发病机制相关的生物标志物。关键的组织病理学标志物包括壁上皮细胞（PECs）侵入肾小球毛细血管[19, 20]，其中PECs中的CD44成为诊断区分因素[21, 22, 23]。先前的研究表明，整合素β与CD9和CD44的共定位会加速FSGS的进展[24]。鉴于整合素α3β1在足细胞粘附到肾小球基底膜中起关键作用[25, 26]，我们研究了整合素α3在FSGS发病机制中的作用。尽管整合素α3在足细胞生物学中的功能作用已有充分记录，但其作为诊断生物标志物的潜力尚未被探索。
我们对INS活检样本（MCD vs FSGS）中整合素α3的分布进行分析，发现表达整合素α3的PECs会迁移到肾小球丛并定位于FSGS的硬化区域。与ANXA3、Claudin-1和Nephrin的共定位证实了其细胞特异性。基于这些发现，我们开发了Int评分——一种量化PECs特异性整合素α3过表达和组织迁移的组织病理学系统。该评分与关键临床病理参数（足突宽度（FPW）、血清白蛋白、24小时蛋白尿和eGFR）相关。ROC整合Int评分将7例初始MCD病例重新分类为可能为FSGS。这些患者与典型MCD患者相比，足突宽度更宽，蛋白尿持续时间更长，eGFR下降更明显。因此，侵入肾小球丛的整合素α3+ PECs可作为早期检测FSGS的生物标志物。
人类组织样本和临床数据
在重庆医科大学儿童医院，从64名符合KDIGO标准的特发性肾病综合征（INS）儿童患者中获取了肾活检样本，排除了继发性和遗传性原因。广州Kingmed诊断实验室（China）通过光镜/免疫荧光/电子显微镜进行了组织病理学分析，诊断为36例MCD和28例FSGS。健康对照组（HC，n=3）来自泌尿外科手术的相邻非肿瘤组织。统计分析
统计分析使用GraphPad Prism版本8.0.1进行。对于两组之间的比较，根据方差同质性的假设，采用了独立样本t检验或Mann-Whitney U检验。分类变量根据情况使用Fisher精确检验或卡方检验进行分析。皮尔逊相关系数用于评估相关性。表格中的数据以平均值和95%置信区间（CI）呈现，散点图用于展示数据分布。MCD和原发性FSGS患者在活检时的临床病理特征
我们对64名INS患者的病理和临床数据进行了回顾性分析，包括36例MCD和28例FSGS（研究设计见图1）。表1总结了活检时的临床病理特征。FSGS患者的血清肌酐和24小时尿蛋白水平显著升高（经体重调整），同时血清白蛋白和eGFR降低（详细信息见补充数据S1）。两组之间没有显著差异。讨论
主要发现显示，活化的整合素α3+ PECs侵入硬化区域附近的肾小球，在73%的FSGS病例中呈局灶性阳性，而在MCD病例中仅为19%。因此，我们开发了半定量Int评分（0-2）来评估PECs特异性整合素α3的表达。该评分在FSGS/MCD的区分中具有显著的诊断准确性（AUC=0.91），并与疾病严重程度指标（蛋白尿、eGFR下降）相关。纵向随访显示……作者贡献
所有作者都参与了本研究的设计。胡友（Hui You）、王国（Kuo Wang）和杨学军（Xuejun Yang）负责材料准备和数据收集，胡友（Hui You）和王国（Kuo Wang）进行了实验。胡友（Hui You）和张明书（Mingshu Zhang）分析了数据。邱莉（Qiu Li）和徐平勇（Pingyong Xu）提供了指导。胡友（Hui You）撰写了初稿，邱莉（Qiu Li）、徐平勇（Pingyong Xu）、杨海平（Haiping Yang）、陈亚曦（Yaxi Chen）、张高富（Gaofu Zhang）和王莫（Mo Wang）进行了审阅和修改。所有作者均批准了最终稿件。
数据可用性声明
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
我们感谢患者在常规病理诊断后慷慨同意捐赠剩余的肾活检样本，从而促进了进一步的医学研究。同时，我们衷心感谢重庆医科大学儿童医院肾脏科在活检过程中提供的关键临床数据，以及泌尿科提供的相邻非肿瘤组织。我们还要感谢病理学部门的……
