《Learning and Motivation》：Application of RNA sequencing to cause-of-death investigation: A pilot study
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法医尸检中常面临临床信息有限导致死因判定困难的挑战。为探索分子水平的解决方案，研究人员开展了基于RNA测序（RNA-seq）技术的死因调查新方法研究。通过对胰岛素过量致死和过敏性休克案例的转录组分析，发现胰岛素信号通路（IRS–PI3K–PDK1/2轴）和FcεRI信号通路下游基因（VAV、IL-4等）特异性激活的表达模式。该研究证明了RNA-seq在捕捉死因相关分子特征方面的潜力，为法医诊断学提供了新型互补工具。
在法医尸检实践中，确定死亡原因常常是一项极具挑战性的任务，特别是当临床病史资料不全时。传统的尸检方法包括大体解剖观察、组织病理学检查和毒物化学分析，但这些手段有时难以揭示死亡瞬间的生理状态。更为棘手的是，常规检测易受主观判断影响，存在观察者偏差。自21世纪初，RNA定量分析被引入法医学领域，通过qRT-PCR（定量逆转录聚合酶链反应）技术检测特定基因的表达变化，为死因调查提供了新思路。然而，这种假设驱动的方法只能针对预先选定的有限靶点，无法全面捕捉死亡过程中复杂的分子事件。
随着下一代测序（NGS）技术的发展，RNA测序（RNA-seq）技术应运而生。它能够无偏倚地扫描整个转录组，不仅有助于减少主观偏差，还可能发现新的生物标志物和未知的病理生理通路。尽管RNA-seq在法医学中已被用于估计死后间隔（PMI）和体液识别，但其在死因调查方面的应用仍处于起步阶段。正是在这一背景下，来自广岛大学的研究团队开展了这项开创性的试点研究，旨在探索RNA-seq技术是否能够捕捉到与特定死因相关的分子签名。
本研究主要采用了以下关键技术方法：从尸检血液样本中提取总RNA后，使用rRNA去除试剂盒构建链特异性cDNA文库，并在DNBSEQ-G400平台上进行150 bp双端测序。通过生物信息学流程（包括FASTQC质控、Trimmomatic修剪和Kallisto定量）进行基因表达定量，并采用DESeq2包的相对对数表达（RLE）归一化法进行跨样本比较，重点分析KEGG数据库中的胰岛素信号通路、FcεRI信号通路、B细胞受体通路和T细胞受体通路相关基因表达变化。
6.1 胰岛素过量致死案例
研究人员将RNA-seq数据经过RLE标准化处理后，发现与两个对照案例（缢死和失血性休克）的平均值相比，胰岛素过量案例中胰岛素信号通路的关键组分呈现显著上调。具体表现为胰岛素受体底物（IRS）-磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1/2（PDK1/2）轴明显激活。其中IRS、PI3K、PDK1/2、蛋白磷酸酶1（PP1）和糖原合酶（GYS）等基因表达强烈上调，这与增强的糖原合成、糖酵解等降血糖过程相符。此外，其他信号适配分子（如Flotillin、APS、Cbl等）和下游效应因子（包括固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）、AMP活化蛋白激酶（AMPK）、葡萄糖激酶（GK）等）也同步上调。值得注意的是，胰岛素信号通路的平行分支——包括磷酸二酯酶3（PDE3）-蛋白激酶A（PKA）轴、PI3K–Akt轴以及MAPK通路（含GRB2、SOS、Raf、MEK1/2、ERK1/2等）——均显示广泛激活。这些结果表明胰岛素过量导致了全身性胰岛素信号通路的全面放大，涵盖葡萄糖代谢、脂质与糖原合成以及生长相关通路。
6.2 过敏性休克致死案例
在疑似头孢类抗生素引发的过敏性休克案例中，RNA-seq分析显示，虽然FcεRI信号通路和B细胞受体信号通路的基因表达在聚类分析中未能清晰区分案例与对照组，但T细胞受体信号通路却呈现出明显的分离模式。进一步分析发现，在肥大细胞的FcεRI信号通路中，FcεRI本身及其下游介质（如VAV、p38、胞质磷脂酶A2（cPLA2）、白细胞介素-3（IL-3）、IL-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF））的表达均有所升高。相反，B细胞受体通路中仅PIR-B基因表达增加。而T细胞受体信号通路则呈现广泛上调，包括共受体（CD4、CD8）、CD3链（CD3ε、CD3γ、CD3δ）、共刺激/检查点分子（PD-1、CTLA-4、CD40L、CD28）以及下游信号分子（NCK、PAK、VAV、IκB、p38、IL-4、GM-CSF）。这些表达变化提示了IgE介导的免疫应答增强，特别是T细胞活化在过敏性休克的发病机制中可能发挥重要作用。
本研究首次将RNA-seq技术成功应用于法医死因调查的实际案例，证明了该技术能够捕捉到与特定死亡机制相关的分子特征。在胰岛素过量案例中，研究人员观察到了胰岛素信号通路的全面激活；在过敏性休克案例中，则检测到FcεRI和T细胞受体通路相关基因的上调。这些发现表明，转录组分析有望成为传统法医诊断方法的有效补充工具。
与以往主要依赖qRT-PCR的基因分析方法相比，RNA-seq具有无偏倚、全面扫描整个转录组的优势，不仅能够验证已知通路，还可能发现新的候选基因和未知的病理生理过程。这对于死因不明案例的深入调查具有重要价值。该研究的创新性在于将高通量测序技术直接应用于法医死因诊断场景，为死后分子诊断学开辟了新方向。
然而，研究也存在明显局限性。样本量过小（每个死因类别仅一例）限制了结果的普适性，且法医案例本身存在选择偏倚。RNA在死后极易降解，受死后间隔（PMI）和保存条件影响显著，尽管采用rRNA去除策略提高了信噪比，但无法完全克服RNA降解带来的技术挑战。此外，RNA-seq目前仍面临成本高、耗时长、需要专业生物信息学分析能力等问题，短期内难以常规应用于法医实践。
尽管如此，随着测序成本的持续降低和技术的不断进步，RNA-seq及其它组学技术在法医学中的应用前景广阔。未来需要通过积累更多案例、系统研究死后RNA降解规律、优化实验流程等途径，逐步推动该技术向标准化、实用化方向发展。这项试点研究为死后转录组学在法医学中的应用提供了概念验证，标志着法医病理学开始进入多组学时代。
