Oreoch-1对肠侵袭性大肠杆菌感染的抗毒力活性及免疫调节作用

《Microbial Pathogenesis》：Anti-virulence activity and immunomodulation of Oreoch-1 against enteroinvasive Escherichia coli infection

本研究评估了尼罗 tilapia 来源的23-mer阳离子肽Oreoch-1对肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）毒力因子（ial, icsA等）及炎症因子（IL-6, IL-8等）的调控作用，发现其在体外模型中具有显著抗毒力活性，可能为应对多重耐药EIEC的新型抗菌肽提供候选。

　　

弗朗切斯卡·帕尔马（Francesca Palma）| 罗莎·朱利亚诺（Rosa Giugliano）| 安娜丽莎·基亚内塞（Annalisa Chianese）| 罗伯塔·德拉马尔卡（Roberta Della Marca）| 亚历山德拉·蒙蒂（Alessandra Monti）| 努齐安娜·多蒂（Nunzianna Doti）| 卡拉·扎内拉（Carla Zannella）| 马西米利亚诺·加尔迪埃罗（Massimiliano Galdiero）| 安娜·德菲利皮斯（Anna De Filippis）

意大利那不勒斯，坎帕尼亚大学“路易吉·范维泰利”（University of Campania "Luigi Vanvitelli"）实验医学系，邮编80138

摘要

肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive Escherichia coli，简称EIEC）是导致感染性腹泻的主要病原体，与发病率和死亡率密切相关。其致病性依赖于大型毒力质粒pINV中携带的特定毒力因子。鉴于近期爆发的疫情以及耐药性EIEC菌株的惊人出现，亟需创新的干预措施。抗毒力干预方法显示出巨大潜力，因为它针对的是细菌的毒力而非生存能力，从而降低了诱导耐药性的风险。在这方面，抗菌肽（Antimicrobial Peptides，简称AMPs）因其广谱抗菌活性而受到关注。本研究在EIEC感染的体外模型中，探讨了源自尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的23个氨基酸组成的阳离子肽Oreoch-1的抗毒力和免疫调节作用。我们通过肉汤稀释法用Oreoch-1（浓度为3.125-25 μM）处理EIEC ATCC 43983菌株，并评估了其在6.25-12.5 μM范围内的效果。随后，我们研究了Oreoch-1对结肠癌细胞系（Caco-2）中细菌侵袭过程的影响，特别是其对EIEC关键毒力因子（ial、icsA、icsB、ipaB、ipaC、virB和virF）的调节作用，以及其对炎症细胞因子（IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和TGF-β）表达的调控效果。这些因子在细菌和宿主双方的感染过程中均起着关键作用。基于这些有希望的结果，Oreoch-1可能成为解决广泛耐药性问题的新型抗菌肽。

引言

腹泻是胃肠道物理和化学屏障受损的临床表现，导致消化道内水分和离子转运失衡，这与细菌、病毒和真菌等微生物密切相关。感染性腹泻是全球发病率和死亡率的主要原因之一，尤其是在发展中国家，全球每年有110万人因此死亡[1][2]。2018年的全球疾病、伤害和风险因素研究（Global Burden of Diseases, Injuries, and Risk Factors Study，简称GBD）分析了195个国家的腹泻情况，指出尽管在应对腹泻疾病方面取得了显著进展，但5岁以下儿童和老年人仍需特别关注[3]。肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）是发展中国家细菌性痢疾的主要原因，因为它能引发强烈的肠道炎症反应，表现为腹泻、发热以及粪便中带血和黏液[3][4][5]。EIEC的毒力源于其侵入结肠细胞、在感染肠上皮细胞胞质中复制并扩散到邻近细胞的能力[6][7]。编码毒力因子的基因主要存在于一个大型（>200 kb）的毒力质粒pINV中，该质粒仅存在于EIEC和志贺菌属（Shigella）中[8]。实际上，这两种细菌在致病机制和生活方式上具有显著相似性[9]。尽管EIEC菌株通常引起散发感染，但最近全球范围内仍发生了多起疫情[5][10][11][12]。虽然阿奇霉素和环丙沙星等抗生素仅推荐用于重症病例，但已报告出现多重耐药性EIEC菌株，这凸显了创新干预措施的必要性[9][13][14][15]。世界卫生组织（WHO）已将第三代头孢菌素和碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌（Enterobacterales）列为新抗生素开发的优先目标（WHO细菌优先病原体清单，2024年：对公共卫生具有重要意义的细菌病原体，用于指导研究、开发和制定抗菌素耐药性防控策略。日内瓦：世界卫生组织，2024年9月4日访问）。近年来，抗菌肽（AMPs）作为一种补充性抗感染剂应运而生，它们通常是短链、带正电荷的分子，具有广谱抗菌活性。本研究在EIEC感染的体外模型中验证了Oreoch-1的抗毒力和免疫调节潜力。

Oreoch-1肽的合成

C末端酰胺化的Oreoch-1肽（代码：FIHHIIGGLFSVGKHIHGLIHGH-NH2）的合成、表征及其细胞毒性评估已在我们的先前研究中详细描述[34][35]。

血清稳定性检测

血清稳定性检测方法按照文献中的描述进行[36]。简要来说，将Oreoch-1与10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，Microgem，Pozzuoli，IT）混合，最终浓度为2.0 mg/mL，置于Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1×，Microgem）中。

Oreoch-1的血清稳定性

通过将Oreoch-1肽在FBS溶液中孵育24小时来评估其对抗蛋白酶降解的稳定性。图1显示了指定时间点（0.5、1、2、4、6和24小时）下RP-HPLC峰面积与0小时峰面积的比值，从而计算出完整肽的相对百分比。如图1所示，在血清存在下，完整肽的比例在最初4小时内逐渐下降。

讨论

抗菌肽（AMPs）凭借其结构和功能的多样性，为新型生物活性肽的合成提供了有效模板[47]。Blyth等人强调了胃肠道（GIT）在维持屏障和分泌抗菌肽以防止感染方面的代谢和免疫作用[17]。肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）能够突破黏膜防御机制，侵入肠上皮细胞并引发感染。

结论

目前已有几种抗菌肽进入临床阶段，但只有少数获得了监管机构的批准。天然和合成化合物在亚活性浓度下的抗毒力作用引起了科学界的关注，因为它们有望同时控制微生物感染并避免耐药性的产生[20]。在这方面，Oreoch-1凭借其对多种病原体的广谱抗性，可能成为一种有前景的抗毒力候选物质。

CRediT作者贡献声明

安娜·德菲利皮斯（Anna De Filippis）：撰写、审阅和编辑；概念构思。 马西米利亚诺·加尔迪埃罗（Massimiliano Galdiero）：撰写、审阅和编辑。 亚历山德拉·蒙蒂（Alessandra Monti）：方法学设计。 罗伯塔·德拉马尔卡（Roberta Della Marca）：数据管理。 卡拉·扎内拉（Carla Zannella）：撰写、审阅和编辑。 努齐安娜·多蒂（Nunzianna Doti）：方法学设计。 弗朗切斯卡·帕尔马（Francesca Palma）：撰写初稿、方法学设计。 安娜丽莎·基亚内塞（Annalisa Chianese）：数据管理。 罗莎·朱利亚诺（Rosa Giugliano）：数据管理。

伦理声明

本文不涉及任何动物或人类参与者的研究。

利益冲突

作者声明本研究未涉及任何商业或财务利益冲突。

数据可用性

本研究中的原始数据已包含在文章中；如有进一步疑问，请联系通讯作者。

资助

本研究得到了“严重感染和败血症临床网络：识别临床和诊断标志物、免疫监测以及针对成人、儿童和重症监护病房患者的‘靶向’和个性化治疗——SIS-NET CUP I（项目编号：83C22001810007）”的资助。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。