基于外切核酸酶介导的目标循环扩增技术的电化学发光生物传感器的构建，用于灵敏检测miRNA-21

《Microchemical Journal》：Construction of electrochemiluminescence biosensor for sensitive detection of miRNA-21 based on exonuclease- mediated target recycling amplification

电化学发光生物传感器基于Exo III介导的靶标循环扩增策略，通过Fe-labeled hairpin DNA与miRNA-21结合形成双链后被Exo III降解，释放的miRNA-21重复参与循环扩增，生成大量短链DNA并固定于电极表面，利用Fe对Ru(bpy)?2?/TPA体系的ECL淬灭效应实现高灵敏度检测，线性范围1 pM-100 nM，检测限0.33 pM。

　　

马月|赵瑞娟|荣一鸣|马荣娜|张伟|尚雷|王怀生|贾丽萍

聊城大学化学与化学工程学院，中国聊城252000

摘要

miRNA的特异性表达与多种癌症相关，表明miRNA在肿瘤发展中起着重要作用。细胞内miRNA的含量测定对于肿瘤的预防和早期诊断具有重要意义。本文构建了一种基于外切核酸酶III（Exo III）介导的目标循环扩增的电化学发光生物传感器，用于灵敏检测miRNA-21。铁氰化物（Fc）标记的发夹DNA（Fc-HP）与目标miRNA-21之间的杂交形成双链DNA，随后引发Exo III介导的消化反应，生成大量的Fc标记的短链DNA（Fc-pDNA）并释放目标miRNA-21。释放的miRNA-21继续参与下一个杂交和酶促消化循环，从而实现目标循环扩增。生成的Fc-pDNA通过链置换反应被引入电极表面。利用Fc对Ru(bpy)₃²⁺/TPA体系电化学发光（ECL）的淬灭效应，实现了miRNA-21的检测。在最佳实验条件下，miRNA-21的检测线性范围为1 pM至100 nM，检测限为0.33 pM（信噪比=3）。所构建的传感器对miRNA-21具有高选择性、灵敏度和稳定性。

引言

微小RNA（miRNA）是一类约22个核苷酸的内源性非编码单链RNA。miRNA在人类的生物过程中发挥着重要的调控作用。研究表明，由于miRNA在不同类型癌细胞和不同癌症阶段具有高特异性表达，因此它们可能是理想的癌症标志物。因此，miRNA的特异性表达可以为癌症患者的诊断、分类和治疗提供指导信息。此外，miRNA广泛存在于脑脊液、血清、血浆和唾液等生物流体中[1]，使其成为无创的癌症标志物。然而，选择性测量高度同源序列并灵敏测定低丰度miRNA的含量仍然具有挑战性。因此，开发超灵敏和高选择性的方法来分析生物样本中的miRNA非常重要。

传统的miRNA检测方法包括逆转录-定量聚合酶链反应（qRT-PCR）[2]、基于杂交的微阵列[3]和下一代高通量测序[4]。其中，qRT-PCR技术是目前miRNA分析的金标准，具有极高的灵敏度和特异性[5]。然而，这种方法通常涉及复杂且耗时的过程。最近，一些替代传统方法的技术已被开发出来，包括光学检测[6]、[7]、[8]、电化学检测[9]、[10]和场效应晶体管[12]。电化学发光（ECL）结合了电化学和化学发光的优点，不仅具有化学发光的高灵敏度和宽线性范围，还具备传统电化学方法的稳定性、简单性和便捷性。与传统发光方法相比，ECL具有可控的激发电位和接近零的背景噪声[13]。因此，ECL在miRNA生物传感器的制备中受到了研究人员的广泛关注。刘团队提出了一种基于碱基堆叠杂交和磁性微粒富集技术的ECL平台[14]，该生物传感器的检测限低至1 fM。为了进一步提高检测性能并进一步发展ECL的应用，人们在ECL生物传感器的构建中应用了多种信号放大策略[15]、[16]、[17]。其中，聚合酶链反应、等温扩增等核酸扩增技术在DNA、miRNA、蛋白质、细胞、小分子和离子的检测生物传感器制备中表现出良好的应用前景[18]、[19]、[20]。例如，蒋等人提出了一种新的连接依赖的级联链置换扩增（CSDA）策略，用于高灵敏度分析miRNA。在该研究中，DNA的连接反应、延伸反应、切割反应和循环链置换反应被很好地整合在一起。得益于巧妙的设计，制备的生物传感器表现出高的信号放大效率[21]。受上述研究的启发，我们基于外切核酸酶III（Exo III）介导的目标循环扩增机制，开发了一种灵敏的“信号关闭”型电化学发光生物传感器用于检测miRNA-21。Exo III是一种外切核酸酶，能够选择性地从双链DNA的3′末端逐步去除单核苷酸，广泛应用于各种生物传感器的信号放大[22]、[23]、[24]、[25]。在本研究中，铁氰化物标记的发夹DNA（Fc-HP）能与目标miRNA-21结合形成双链DNA，从而引发Exo III介导的消化反应，生成Fc标记的短链DNA（Fc-pDNA）并释放目标miRNA-21。释放的miRNA-21启动下一个杂交和消化循环，实现目标miRNA-21的循环利用，生成大量Fc-pDNA。然后，通过链置换反应将获得的Fc-pDNA固定在电极表面，以淬灭Ru(bpy)₃²⁺/TPA体系的ECL信号。这种酶促切割循环扩增与界面淬灭的结合显著提高了灵敏度和信噪比。此外，壳聚糖/戊二醛界面的使用增强了传感器的稳定性，而壳聚糖本身的生物相容性和抗干扰性使其适用于复杂样本的分析。

材料与试剂

三（2,2'-联吡啶）钌（II）氯化物六水合物（Ru(bpy)₃Cl₂·6H₂O）购自Alfa Aesar（天津，中国）。三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）和戊二醛购自Sigma-Aldrich（上海，中国）。三丙胺（TPA）购自上海Macklin生化有限公司（上海，中国）。壳聚糖购自J&K Scientific有限公司（北京，中国）。氰化铁钾（K₃Fe(CN)₆）、氰化亚铁钾（K₄Fe(CN)₆、氯化钠

ECL生物传感器的设计原理

ECL生物传感器的设计原理如图1所示。传感器的构建包括两个步骤：（1）Exo III介导的目标循环扩增。在本研究中，铁氰化物标记的发夹DNA（Fc-HP）包含与目标miRNA-21互补的碱基序列。因此，在miRNA-21存在的情况下，Fc-HP的发夹结构会被打开，其中一部分与miRNA-21杂交形成双链结构，3′末端为平末端

结论

总之，基于Exo III介导的目标循环扩增策略，建立了一种新型ECL传感平台，用于miRNA-21的灵敏和选择性分析。与一些已报道的ECL方法相比，本方法表现出更优或相当的性能，如宽线性范围、低检测限和良好的选择性。此外，该生物传感器的制备仅需三种DNA链，因此简单且成本低廉。因此，所制备的ECL生物传感器可能成为一种有应用前景的检测工具

作者贡献声明

马月：撰写——初稿，实验研究。赵瑞娟：方法学设计，实验研究。荣一鸣：验证实验。马荣娜：概念设计。张伟：概念设计。尚雷：撰写——审阅与编辑。王怀生：项目管理。贾丽萍：撰写——审阅与编辑，项目管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本研究得到了山东省自然科学基金（ZR2020MB061）的支持。