《Microchemical Journal》：A novel strategy for visual detection of single-nucleotide polymorphisms (SNPs) leveraging the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay combined with a universal molecular beacon (uMB)
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LAMP与通用分子信标联用实现SNPs可视化检测，验证金枪鱼鉴别灵敏度达0.1pg，闭环管式反应简化操作流程。
Sisi Huang|Shihui Wang|Yan Guo|Hongwei Song|Tianlong Wang|Xiong Xiong|Libin Wang
南京工业大学食品科学与轻工业学院，中国南京211816
摘要
目前迫切需要建立一种快速、灵敏且经济高效的方法来识别单核苷酸多态性（SNPs），这些多态性与个体的病原体反应、表型变异和基因功能密切相关。在这项研究中，我们设计了一种新策略，利用环介导等温扩增（LAMP）技术和通用分子信标（uMB）来实现SNPs的可视化区分。此外，我们还设计了一种精心设计的茎环引物复合体（SPCX），以调控uMB的构象变化。实验结果表明，位于SPCX 3′端的LP区域可以有效确保目标特异性。然而，引入的SNPs会干扰SPCX与LAMP中间产物之间的杂交。值得注意的是，通过将SNPs定位在LP区域互补序列的3′端第三个核苷酸位置，可以实现精确的可视化检测。该方法在金枪鱼鉴定中得到了成功验证，我们选择了具有30 bp LP区域和3 bp Cp区域的SPCX（BE-a6y4–3-1）。使用这种优化的SPCX，检测所需的最小基因组DNA量低至0.1 pg。
因此，我们的策略采用了一步法、封闭管操作的方式，展示了在等位基因区分和信号可视化方面解决问题的潜力。
引言
单核苷酸多态性（SNPs）主要指基因组水平上单个核苷酸发生变化所导致的DNA序列差异，这些差异与个体的病原体反应、表型变异和基因功能密切相关[[1], [2], [3]]。当前的研究还强调了SNPs在生态学和生物医学研究中的广泛应用，这些研究利用SNPs来探讨物种间的系统发育关系和进化路径[[4,5]]。在精准医疗快速发展的背景下，灵敏可靠的SNPs检测方法显得尤为重要，因为它能提供关于个体遗传易感性、疾病预后以及对治疗反应的宝贵信息，从而在推进个性化医疗方面发挥关键作用[[6], [7], [8]]。
聚合酶链反应（PCR）是一种用于扩增核酸的基本技术，长期以来一直被认为是SNPs检测最可靠的方法之一。常用的技术是基于PCR的限制性片段长度多态性分析，通过特定的限制性内切酶消化DNA并区分突变，然后通过凝胶电泳进行鉴定[[9]]。此外，TaqMan检测和高分辨率熔解分析（HRM）方法也被验证可用于葡萄酒和果汁等产品的SNPs基因分型[[10]]。尽管PCR在扩增核酸方面非常有效，但由于需要复杂的PCR仪器以及精确的温度控制和荧光检测，这使得在资源有限的环境中难以应用该技术。特别是在即时诊断（POC）场景中，快速准确的诊断结果至关重要，但先进实验室设备的可用性有限[[11]]。鉴于这些挑战，开发高度灵敏且适用于POC应用的检测方法一直是当前研究领域的重点。
基于其优异的特异性和简便性，等温扩增技术最近经历了创新发展，并被广泛应用于核酸检测领域。这些技术包括滚环扩增、重组酶聚合酶扩增和环介导等温扩增（LAMP）[[12], [13], [14]]。它们的等温特性消除了对复杂热循环装置和重复温度变化的需求。此外，还开发了多种比色检测技术，便于阳性样本的快速可视化和识别，为POC应用带来了巨大潜力[[15]]。其中，由Notomi等人开发的LAMP技术[[16]]是一种特别灵敏且快速的基因扩增方法，它使用针对目标序列设计的特异性引物进行自我重复链置换合成。该技术已被用于检测病原体、过敏原和食品成分，显示出在分子诊断领域的巨大潜力[[17], [18], [19], [20]]。
最近的研究表明，LAMP具有区分单碱基差异的能力，从而能够检测SNPs[[21,22]]。例如，开发了一种基于直接LAMP的准确、快速且易于使用的SNPs检测系统，无需DNA提取，其中SNP特异性引物会导致扩增速度的显著差异[[11]]。除了使用引物设计技术进行SNPs检测外，还设计了一种利用酶激活的环状引物探针的LAMP检测方法，用于识别沙门氏菌[[23]]。其他策略还使用荧光DNA探针在LAMP产物中检测SNPs。这些探针是含有淬灭荧光染料的DNA双链结构，能够特异性地结合SNP序列而非非SNP序列[[24]]。尽管这些系统在SNPs分析中表现出灵敏性和特异性，但仍存在一些局限性，如探针设计复杂、需要额外酶以及现场检测时面临的高设备成本和技能要求等问题。
在这项研究中，我们通过将LAMP与通用分子信标（uMB）结合，开发了一种新的SNPs可视化检测方法。具体来说，在反应开始前，除了其他LAMP试剂外，还预先加入了一种精心设计的uMB和茎环引物复合体（SPCX）。只有当存在目标DNA时，SPCX才会打开，并随后重新排列以作为uMB的互补分析物；然而，SPCX 3′端的单个核苷酸变异会严重影响这一过程[[25,26]]。DNA错配会显著增加SPCX展开的难度，导致阴性样本无法产生荧光。这种新型检测方法采用一步法、封闭管操作的方式，有效解决了等位基因区分和信号可视化之间的问题。此外，uMB的参与实现了序列特异性的LAMP检测，从而降低了假阳性结果的可能性，并提高了灵敏度。当目标序列发生变化时，无需重新设计和合成uMB，大大降低了成本和复杂性。最后，我们在金枪鱼鉴定中对该方法进行了验证，成功建立了基于SNPs的物种特异性检测方法，用于识别大眼金枪鱼（Thunnus obesus）。
样本收集和引物设计
为了验证该方法，我们从之前的研究中获得了11个物种的真实样本[[27]]，包括T. obesus（MN893173）、T. alalunga（MN893175）、T. albacares（MN893174）、Katsuwonus pelamis（MK843764）、Scomberomorus niphonius（MN879568）、Carassius auratus（MK843660）、Xiphias gladius（MN893182）、Dissostichus mawsoni（MK843765）、Scomber scombrus（MN893176）、Scomber sp.（MK843721）和Mugil cephalus（MN893207）。按照制造商提供的指南，我们...
可视化LAMP检测原理
我们利用LAMP和uMB进行SNPs可视化检测的原理如图1所示。具体来说，uMB和SPCX被提前加入反应体系，同时加入所有LAMP所需的引物和其他试剂。根据LAMP的基本原理，最初会形成一个具有两个环的哑铃形中间产物[[29]]。我们设计了一种SPCX，用于从LAMP产物中提取并转换目标信号...
结论
总之，我们开发了一种将LAMP与uMB结合的新方法，用于SNPs的可视化识别。通过这种策略，精心设计的SPCX能够触发uMB的构象变化。通过将SNPs精确定位在LP区域互补序列的3′端第三个核苷酸位置，成功实现了可视化检测。这一新方法在SNPs检测领域代表了重大进展。
CRediT作者贡献声明
Sisi Huang：撰写 – 原稿撰写、可视化、方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理。Shihui Wang：方法学设计、实验研究。Yan Guo：软件开发、实验研究。Hongwei Song：实验研究、概念构思。Tianlong Wang：软件开发。Xiong Xiong：撰写 – 审稿与编辑、原稿撰写、实验指导、方法学设计、资金获取、概念构思。Libin Wang：方法验证。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了江苏省研究生研究与实践创新计划（编号：SJCX23_0502）和江苏省高校自然科学研究计划（编号：21KJB550011）的支持。
