《Phytomedicine》：Pharmacological inhibition of PGK1 by genipin reduces inflammation and oxidative damage in osteoarthritis
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骨关节炎治疗新策略：首次证实栀子苷通过共价抑制PGK1活性，调控Keap1-Nrf2/NF-κB信号通路减轻炎症和软骨降解。
李美晨|彭毅|肖晴晴|陈思怡|张春杰|陈洪宇|赵月|常珊|邱璐|张乐乐|郭晓强|傅强
中国成都大学药学院四川抗生素工业研究所，成都610106
摘要
背景
骨关节炎（OA）是一种慢性退行性关节疾病，其特征是关节软骨的退化和滑膜炎症。由于治疗靶点的不确定性，目前尚无针对核心机制的有效干预措施。栀子苷是Gardenia jasminoides Ellis果实的主要活性成分之一，在抗炎和软骨保护方面具有巨大的应用潜力。
目的
本研究旨在阐明栀子苷在减轻骨关节炎相关软骨损伤中的直接分子靶点和作用机制。
方法
在TNF-α诱导的C28/I2细胞模型中评估了栀子苷的体外治疗效果。使用CC-ABPP、SPR等实验确定了栀子苷在OA中的潜在治疗靶点。通过LC-MS/MS、分子对接分析等方法研究了栀子苷的结合位点。进一步通过检测下游代谢物和蛋白质的变化来阐明栀子苷的治疗机制。
结果
PGK1被确定为栀子苷在OA中的关键治疗靶点。栀子苷与PGK1的赖氨酸216共价结合，占据其核苷酸结合域（NBD），阻断ATP的相互作用，从而竞争性地抑制PGK1的活性。进一步研究表明，栀子苷可提高甲基乙二醛（MGO）的水平，MGO是PGK1的上游代谢物，激活Keap1-Nrf2抗氧化通路，同时抑制NF-κB介导的炎症，下调基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，减少细胞外基质（ECM）的降解，最终保护软骨。
结论
栀子苷是一种共价PGK1抑制剂。栀子苷通过特异性靶向PGK1的NBD域并调节Keap1-Nrf2/NF-κB信号通路来发挥其抗OA作用。
引言
骨关节炎（OA）是一种常见的慢性关节疾病，主要表现为关节功能受限、僵硬和持续疼痛（Yao等人，2023年）。在OA的发病过程中，多种炎症因子上调并持续攻击软骨，导致关节软骨损伤和关节磨损（S. Liu等人，2022年；Chow和Chin，2020年）。非甾体抗炎药（NSAIDs）和糖皮质激素可以提供短期的抗炎效果；然而，这些药物的长期使用可能导致严重的不良反应，从而限制了其在OA治疗中的应用（Salis和Sainsbury，2024年）。目前，尚无针对OA软骨炎症损伤的靶向疗法（Zhao等人，2023年）。因此，深入探索新的治疗靶点和潜在的软骨保护药物具有重要的临床意义。
软骨细胞是成熟关节软骨中唯一的细胞类型。由于关节软骨缺乏血管结构，软骨细胞存在于相对缺氧的微环境中，主要依靠糖酵解途径满足能量需求并维持细胞功能（Adam等人，2024年；F. Zhang等人，2023年）。作为糖酵解中的关键酶，磷酸甘油酸激酶1（PGK1）催化1,3-二磷酸甘油酸（1,3-BPG）可逆转化为3-磷酸甘油酸（3-PG），同时产生ATP（Fu和Yu，2020年；H. Liu等人，2022年）。作为一种多功能酶，PGK1对能量代谢至关重要，并通过抗氧化和抗炎功能调节各种生理和病理过程。例如，在神经退行性疾病中，PGK1的激活不仅改善了细胞能量代谢紊乱，还通过其抗氧化能力保护神经元（McHale-Owen等人，2025年）。在急性肺损伤模型中，PGK1促进M1型巨噬细胞的极化并诱导凋亡，从而加剧炎症反应（Zhu等人，2024年）。此外，PGK1与NLRP3炎性小体相互作用并调节其磷酸化，这可以抑制炎症反应（Zhu等人，2024年）。此外，PGK1催化中心C端结构的翻译后修饰可以显著改变其酶活性和构象。例如，内源性修饰研究表明，多个赖氨酸残基（Lys220、Lys323和Lys388）的乙酰化（Wang等人，2015年；Gao等人，2024年；Qian等人，2017年）以及各种丝氨酸（Ser203和Ser256）、苏氨酸（Thr243）和酪氨酸（Tyr324）残基的磷酸化（Li等人，2016年）可能通过调节PGK1构象而产生抗肿瘤效应（Zhang等人，2018年；Qian等人，2019年）。外源性修饰研究表明，特拉唑嗪与PGK1的C端结构结合，增强活性位点内的ADP结合亲和力，从而激活其催化活性（Chen等人，2015年）。值得注意的是，研究证实PGK1在类风湿性关节炎（RA）患者的滑膜组织和血液中显著上调，PGK1被确定为胶原诱导的关节炎（CIA）大鼠模型中的蛋白质组网络的核心节点（Zhao等人，2016年）。在炎症性肠病（IBD）和败血症等其他情况下也观察到PGK1表达升高（Liu等人，2024年）。这些证据表明PGK1与炎症反应之间存在关键联系。然而，PGK1在OA发病机制中的潜在作用和精确的分子机制仍大部分未得到探索，需要进一步研究。尽管在各种疾病中对PGK1相关机制进行了广泛研究，但针对PGK1开发的药物或化合物很少。特拉唑嗪是一种直接的PGK1激动剂，可增加细胞内ATP的产生，进而激活HSP90，帮助保护器官免受损伤。另一项研究报告称，CBR-470–1是一种直接的PGK1抑制剂，可抑制其活性，导致上游代谢物的积累并产生细胞保护作用。目前，PGK1抑制剂的精确结合位点尚未确定，这阻碍了PGK1抑制剂开发的必要指导。
栀子苷是Gardenia jasminoides Ellis果实中的一种环烯醚萜类化合物。在传统中医中，G. jasminoides的果实以其清热解毒、利尿凉血和排毒的功效而闻名。环烯醚萜苷是主要的活性成分（Shi等人，2019年；Chen等人，2020年）。根据2020年版《中国药典》，G. jasminoides果实中的栀子苷含量不应低于1.8%。现代药理学研究表明，栀子苷在胶原和佐剂诱导的关节炎模型中显著减轻足部肿胀，并通过抑制IL-1β和TNF-α等炎症因子发挥抗炎作用。栀子苷通过多种信号通路发挥作用，包括Itgβ1/Ras-Erk1/2、NF-κB、MAPK和JNK（Wang等人，2017年，2018年；Hu等人，2019年）。此外，栀子苷通过PI3K/Akt/NF-κB通路保护关节软骨（Pan等人，2018年）。然而，作为栀子苷的活性代谢物和苷元的栀子苷的抗OA机制仍不清楚。
在我们的研究中，我们发现栀子苷在体外和体内通过与软骨细胞中的PGK1蛋白直接相互作用而表现出显著的抗OA效果。进一步研究表明，栀子苷通过共价修饰PGK1的赖氨酸216与其核苷酸结合域（NBD）结合，导致与ATP的空间重叠，从而竞争性地抑制PGK1的催化活性。此外，栀子苷通过抑制PGK1介导的糖酵解促进甲基乙二醛（MGO）的积累。MGO的积累通过翻译后修饰在Keap1的近端半胱氨酸和精氨酸残基之间形成新的甲基咪唑交联，促进Keap1二聚化并激活Nrf2信号通路（Bollong等人，2018年）。此外，Nrf2的激活上调了抗氧化和抗炎酶HO-1的表达，进而抑制NF-κB活性并减少促炎因子的产生（Tonolo等人，2022年）。因此，栀子苷通过调节Keap1-Nrf2/NF-κB通路、下调基质金属蛋白酶的表达和抑制细胞外基质的降解过程来发挥其抗OA作用。总体而言，这项研究首次证明栀子苷是一种新型的共价PGK1抑制剂，为PGK1靶向药物设计提供了新的方向。靶向和抑制PGK1显示出作为OA治疗策略的潜力。
试剂
栀子苷（CAS编号：6902–77–8，纯度≥98%），栀子苷（CAS编号：24,512–63–8，纯度≥98%），1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDCI）（CAS编号：25,952–53–8，纯度≥98%），4-二甲基氨基吡啶（DMAP）（CAS编号：1122–58–3，纯度≥99.8%），4-戊烯酸（CAS编号：6089–09–4，纯度≥98%），三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺（TBTA）（CAS编号：510,758–28–8，纯度≥97%），以及三(2-羧乙基)膦（TCEP）（CAS编号：51,805–45–9，纯度
栀子苷在体外
图中展示了栀子苷的结构（图1A）。为了研究栀子苷对人类C28/I2软骨细胞的细胞毒性，将栀子苷给药24小时。在6.25、12.5、25和50 μM的浓度下，栀子苷对C28/I2细胞没有表现出细胞毒性（图1B）。这表明栀子苷在软骨细胞中具有良好的安全性。随后，为了评估栀子苷的保护作用，C28/I2软骨细胞暴露于TNF-α。TNF-α处理显著减少了细胞
讨论
栀子苷是一种天然存在的环烯醚萜类化合物，主要来源于G. jasminoides Ellis的干燥成熟果实，也可以通过β-葡萄糖苷酶介导的栀子苷水解获得。栀子苷长期以来被用作丝绸和棉纺织品的天然染料，并广泛用作食品加工行业中的安全无毒食品色素（Chen等人，2020年）。此外，栀子苷在生物材料工程领域也有广泛应用。
结论
总体而言，我们的研究结果表明PGK1是OA治疗的有希望的治疗靶点。此外，PGK1中的Lys216是一个具有巨大潜力的可药物化位点，为PGK1抑制剂的设计提供了新的见解。此外，我们确定栀子苷是OA治疗中关键的small molecule抑制剂。未来对栀子苷的结构修饰可能会开发出更具临床转化潜力的候选分子。
作者声明
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CRediT作者贡献声明
李美晨：撰写——初稿，可视化，数据整理。彭毅：验证，研究，正式分析。肖晴晴：验证，正式分析。陈思怡：验证。张春杰：验证。陈洪宇：验证。赵月：验证。常珊：软件操作。邱璐：监督，项目管理。张乐乐：监督，资源协调。郭晓强：监督，项目管理，方法学。傅强：撰写——审阅与编辑，方法学，资金支持利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：82474046）、成都市科学技术局的关键研发计划（编号：2024-YF05-00544-SN）和四川省自然科学基金（编号：2024NSFSC0710、2024NSFSC2116）的资助。
